馬氏珠母貝珍珠層基質(zhì)蛋白基因的克隆與功能研究.pdf

1、本文在實(shí)驗(yàn)室前期研究基礎(chǔ)上，以本課題組馬氏珠母貝基質(zhì)蛋白全譜為基礎(chǔ)，并以在珍珠囊和中央膜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中高表達(dá)為依據(jù)，篩選出可能與珍珠層形成相關(guān)的6個(gè)基因:4個(gè)沒(méi)有功能注釋的新基因和2個(gè)有絲氨酸蛋白酶抑制劑功能注釋的基因。通過(guò)RACE和基因克隆技術(shù)獲得這些基因的全長(zhǎng)，對(duì)其序列的結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行分析，通過(guò)Real-time PCR技術(shù)對(duì)各個(gè)基因進(jìn)行組織差異表達(dá)分析，RNA干擾結(jié)合Real-time PCR及掃描電子顯微鏡(SEM)觀察等技術(shù)對(duì)其

2、在珍珠層形成中的功能進(jìn)行初步分析，原位雜交技術(shù)研究基因的表達(dá)定位，進(jìn)一步采用原核表達(dá)技術(shù)獲得重組蛋白并通過(guò)western blot技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證，為確認(rèn)珍珠層形成相關(guān)的礦化基因與蛋白的對(duì)應(yīng)關(guān)系，揭示珍珠層的分子調(diào)控機(jī)制研究提供依據(jù)。
　　1.四個(gè)沒(méi)有功能注釋的新基因按已有命名規(guī)則分別命名為:精氨酸豐富基質(zhì)蛋白(Argnine-rich matrix protein，Pm-RRMP)、甘氨酸豐富基質(zhì)蛋白（Glycine-rich ma

3、trix，Pm-GRMP）、脯氨酸豐富基質(zhì)蛋白(Proline-rich matrixprotein，Pm-PRMP)、絲氨酸豐富基質(zhì)蛋白（Serine-rich matrix protein，Pm-SRMP），cDNA全長(zhǎng)分別為1063bp、2088bp、2312bp、3154bp，分別編碼273、565、589和958個(gè)氨基酸，均為具有信號(hào)肽執(zhí)行胞外功能的分泌蛋白。同樣，利用Real-time PCR技術(shù)進(jìn)行基因組織差異表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)

4、除了Pm-RRMP，另外3個(gè)基因的mRNA都主要在外套膜中央?yún)^(qū)及珍珠囊中呈現(xiàn)高表達(dá)，可能參與珍珠層的礦化過(guò)程，而Pm-RRMP在邊緣膜中呈現(xiàn)高表達(dá)可能與貝殼棱柱層形成相關(guān)。RNA干擾后目的基因在外套膜中央?yún)^(qū)的表達(dá)量顯著下降，結(jié)合SEM觀察貝殼內(nèi)表面的超微結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，珍珠層結(jié)構(gòu)排列不規(guī)則，片層之間界限模糊，有融合的趨勢(shì)，說(shuō)明這4個(gè)基因在貝殼形成過(guò)程中起著重要作用。另外原位雜交研究還發(fā)現(xiàn)馬氏珠母貝Pm-PRMP基因的mRNA表達(dá)定位于外套膜的

5、外表皮，進(jìn)一步證明它與珍珠層形成相關(guān)。
　　2.兩個(gè)有絲氨酸蛋白酶抑制劑功能注釋的基因分別命名為Pm-NSPI-1、Pm-NSPI-2，cDNA全長(zhǎng)分別為766 bp和702 bp，分別編碼164和183個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)分析均具有信號(hào)肽，說(shuō)明兩者均為分泌蛋白。成熟肽中都存在2個(gè)串聯(lián)的Kunitz型絲氨酸蛋白酶抑制劑基因家族結(jié)構(gòu)域，根據(jù)這些特有的序列特征，我們初步確定本實(shí)驗(yàn)所克隆的2條序列均為馬氏珠母貝Kunitz型絲氨酸蛋白酶抑制劑

6、家族成員。利用Real-time PCR技術(shù)進(jìn)行基因的組織差異表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，這2個(gè)基因都主要在外套膜中央?yún)^(qū)及珍珠囊組織中高表達(dá);RNA干擾后發(fā)現(xiàn)目的基因在中央膜的表達(dá)量顯著下降，SEM觀察發(fā)現(xiàn)干擾后珍珠層結(jié)晶體表面粗糙，排列錯(cuò)亂，六邊形結(jié)構(gòu)不明顯;運(yùn)用原位雜交技術(shù)進(jìn)行組織定位，研究發(fā)現(xiàn)Pm-NSPI-2基因的mRNA特異性地表達(dá)于外套膜的外表皮，這些研究結(jié)果均可表明篩選出的有絲氨酸蛋白酶抑制劑功能注釋的目的基因均在珍珠層的形成中發(fā)揮重要

7、作用。通過(guò)構(gòu)建Pm-NSPI-1和Pm-NSPI-2的原核表達(dá)重組質(zhì)粒，在大腸桿菌中進(jìn)行優(yōu)化表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Pm-NSPI-1重組蛋白在IPTG濃度為0.1mM，誘導(dǎo)時(shí)間為12h，誘導(dǎo)溫度為37℃時(shí)為其蛋白誘導(dǎo)的最佳條件;而相應(yīng)地Pm-NSPI-2在IPTG濃度為0.8mM，誘導(dǎo)時(shí)間為8h，誘導(dǎo)溫度為37℃時(shí)為其蛋白誘導(dǎo)的最佳條件，兩者均以包涵體的形式存在。利用Westem blotting技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn):優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)的重組蛋白能夠與帶有His