大鼠肝臟再生時(shí)線粒體通透性轉(zhuǎn)換相關(guān)因素的研究.pdf

1、創(chuàng)傷和各種肝病后，殘存肝組織很快會(huì)進(jìn)入復(fù)雜的再生過(guò)程。研究肝再生分子機(jī)理必將對(duì)肝臟移植、創(chuàng)傷、各種肝病及肝腫瘤診治具有重要意義。但是目前對(duì)肝再生的分子機(jī)理，尤其是肝再生啟動(dòng)和終止的機(jī)制仍不清楚。而能量代謝的調(diào)控始終是肝細(xì)胞再生過(guò)程中的重要環(huán)節(jié)，線粒體不僅為細(xì)胞生命活動(dòng)提供所需的能量，而且直接參與細(xì)胞內(nèi)許多信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程。許多研究表明線粒體通透性轉(zhuǎn)換(permeability transition，PT)是這一切功能的重要環(huán)節(jié)，在肝再生過(guò)程

2、中線粒體通透性發(fā)生了明顯變化，這對(duì)肝再生可能具有重要意義。 因此，我們對(duì)大鼠肝再生過(guò)程中線粒體PT時(shí)相規(guī)律進(jìn)行了研究：發(fā)現(xiàn)大鼠肝再生過(guò)程中肝部分切除(70％partial hepatectomy，PH)后3h和6h肝線粒體有一定的收縮，24h線粒體通透性明顯升高和線粒體明顯腫脹，在肝再生后期(PH后120～168h)肝線粒體又經(jīng)歷了收縮和腫脹的變化過(guò)程。這提示線粒體PT可能與肝再生的啟動(dòng)與終止有關(guān)。線粒體PT的物質(zhì)基礎(chǔ)是線粒體

3、內(nèi)膜和外膜接觸點(diǎn)處存在的一種蛋白性孔道，即所謂線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(permeability transition pore，PTP)。PTP具有可逆性開閉的特性，異常的高通透性開放會(huì)導(dǎo)致線粒體跨膜電位消失和凋亡因子釋放等。PTP是線粒體內(nèi)外信息交流的環(huán)節(jié)，功能的發(fā)揮依賴于其開閉的狀態(tài)。多種因素可調(diào)節(jié)PTP開閉，除了自由基、Ca<'2+>等因素外，還有一些調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白：PBR是線粒體PTP的一個(gè)重要組分和調(diào)節(jié)蛋白，在調(diào)節(jié)線粒體誘導(dǎo)的凋亡中

4、起重要作用。苯二氮卓類結(jié)合抑制因子(diazapam-binding inhibitor，DBI)是PBR的內(nèi)源性配體，能夠取代苯二氮卓類與PBR結(jié)合，普遍存在于生物體中，DBI與PBR相互作用能夠通過(guò)調(diào)節(jié)線粒體PT，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，DBI能與脂酰CoA結(jié)合，促進(jìn)其轉(zhuǎn)運(yùn)入線粒體基質(zhì)，調(diào)節(jié)能量代謝，促進(jìn)線粒體合成類固醇，所以DBI又被稱為脂酰CoA結(jié)合蛋白(acyl-CoA-binding protein)。 活性氧族(React

5、ive oxygen species，ROS)是一個(gè)重要的PT誘導(dǎo)因素，而線粒體消耗的氧約有2～5％用于生成ROS，主要是呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ、Ⅲ漏出的電子直接與氧反應(yīng)生成的；線粒體PTP開放又可引起線粒體產(chǎn)生ROS。有研究報(bào)導(dǎo)肝再生早期自由基與線粒體功能兩者呈現(xiàn)十分明顯的消長(zhǎng)關(guān)系，這表明在肝再生過(guò)程中對(duì)ROS變化的規(guī)律與線粒體PT變化關(guān)系的研究，將有助于認(rèn)識(shí)肝再生過(guò)程中調(diào)節(jié)肝細(xì)胞線粒體PT的可能機(jī)理。 Ca<'2+>也是一個(gè)重要的線粒體PT

6、誘導(dǎo)因素，有研究報(bào)導(dǎo)在肝再生過(guò)程中線粒體中Ca<'2+>濃度發(fā)生變化，當(dāng)Ca<'2+>由胞質(zhì)中進(jìn)入線粒體基質(zhì)中時(shí)，線粒體中Ca<'2+>濃度增加，會(huì)導(dǎo)致線粒體膜電位的改變，繼而調(diào)節(jié)PTP的開放。Ca<'2+>增加可以誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生，從而使線粒體膜通透性升高，同時(shí)Ca<'2+>也可以通過(guò)線粒體PTP轉(zhuǎn)運(yùn)，從而來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞和線粒體的功能，如線粒體呼吸加快，電子漏增加而導(dǎo)致超氧陰離子產(chǎn)生。因此，在肝再生過(guò)程中對(duì)線粒體中Ca<'2+>濃度變化規(guī)

7、律的研究，將有助于認(rèn)識(shí)線粒體PT的可能調(diào)節(jié)機(jī)制。 鑒于上述分析，本課題利用經(jīng)典的大鼠肝再生模型，對(duì)PBR和DBI表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律以及活性氧族和Ca<'2+>的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律進(jìn)行研究，探討在肝再生過(guò)程中線粒體通透性轉(zhuǎn)換的可能機(jī)制，為更好的闡明肝細(xì)胞再生的分子機(jī)理提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 一、肝再生過(guò)程中線粒體PBR及DBI表達(dá)的變化研究肝細(xì)胞線粒體PT的主要調(diào)節(jié)蛋白PBR及其配體DBI的表達(dá)，探討與線粒體PT的關(guān)系。分別以熒光定

8、量RT-PCR方法檢測(cè)PBR和DBI在肝再生過(guò)程中mRNA表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化，以免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)PBR在肝再生過(guò)程中蛋白水平的變化。 結(jié)果顯示，肝再生過(guò)程中PBR基因表達(dá)在6h和2d表達(dá)顯著高于正常組和假處理組(P<0.01)，其他時(shí)間點(diǎn)與假處理組比較無(wú)顯著差異；DBI基因表達(dá)在3h和6h顯著低于正常組和假處理組(P<0.01)，2d的基因表達(dá)高于假處理組(P<0.05)，其他時(shí)間點(diǎn)與假處理組比較無(wú)顯著差異。 PBR

9、蛋白陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目在6h、12h顯著低于正常組(P<0.01)，3d顯著高于正常組(P<0.01)，其他時(shí)間點(diǎn)與正常組比較無(wú)顯著差異；PBR蛋白的陽(yáng)性細(xì)胞平均灰度值在6h高于正常組(P<0.05)，12h低于正常組(P<0.05)，2d和3d具有顯著差異(P<0.01)，其他時(shí)間點(diǎn)與正常組比較無(wú)顯著差異。在肝再生過(guò)程中PBR在細(xì)胞中分布發(fā)生改變，從6h開始，PBR在線粒體膜上分布增多，在2d和3d分布最多，5d和7d在胞膜上分布增多。

10、 結(jié)果提示，肝再生過(guò)程中PBR和DBI表達(dá)，以及PBR分布變化可能與線粒體PT存在正相關(guān)，可能與肝細(xì)胞的增殖和線粒體PT誘導(dǎo)的凋亡調(diào)節(jié)有關(guān)。 二、肝再生過(guò)程中肝細(xì)胞內(nèi)自由基的變化ROS是另外一個(gè)重要的PT誘導(dǎo)因素，本研究分別利用TBA法和硝酸還原法檢測(cè)MDA和NO在肝再生過(guò)程中的變化。 結(jié)果顯示，PH后3h、6h和24h MDA含量高于假處理組(P<0.05)，2dMDA含量與假處理組比較顯著升高(P<0.01

11、)，其他時(shí)間點(diǎn)與假處理組比較無(wú)顯著差異。 肝再生過(guò)程中NO的變化：PH后3h、6h和24h NO含量高于對(duì)照組(P<0.05)，2d、3d和7dNO含量升高與假處理組比較具有顯著差異(P<0.01)，其他時(shí)間點(diǎn)與對(duì)照組比較無(wú)顯著差異。 結(jié)果提示，肝再生早期自由基的升高可能與肝再生早期的線粒體PT變化有關(guān)；在肝再生中期(PH后24h～2d)MDA和NO升高，以及后期(PH后7d)NO 升高可能與線粒體PT升高介導(dǎo)的細(xì)胞

12、凋亡相關(guān)。 三、肝再生過(guò)程中線粒體Ca<'2+>濃度的變化在肝再生過(guò)程中對(duì)線粒體中Ca<'2+>濃度變化規(guī)律的研究，將有助于認(rèn)識(shí)線粒體PT的可能調(diào)節(jié)機(jī)制。 結(jié)果顯示，PH后12h和7d線粒體Ca<'2+>濃度高于對(duì)照組(P<0.05)，24h和2d線粒體Ca<'2+>濃度與對(duì)照組比較顯著升高(P<0.01)，其他時(shí)間點(diǎn)與對(duì)照組比較無(wú)顯著差異。 結(jié)果提示，在肝再生過(guò)程中，線粒體中鈣濃度的增高可能與線粒體PT增

13、高呈正相關(guān)；在肝再生后期(PH后7d)NO增高與Ca<'2+>濃度的升高一致，可能存在相關(guān)性。 小結(jié)：肝再生過(guò)程中PBR和DBI表達(dá)，以及PBR分布變化可能與線粒體PT存在正相關(guān)，可能與肝細(xì)胞的增殖和線粒體PT誘導(dǎo)的凋亡調(diào)節(jié)有關(guān)：肝再生早期自由基的升高可能與肝再生早期的線粒體PT變化有關(guān)；而后期NO升高可能與線粒體在肝再生后期的PT和細(xì)胞凋亡活性增高相關(guān)；線粒體中鈣濃度的增高可能與線粒體PT增高呈正相關(guān)：在肝再生后期(PH后7