線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mPTP)的分子機(jī)理研究.pdf

1、背景：再灌注損傷(Reperfusion injury，RI)是急性心肌梗塞與缺血性中風(fēng)等眾多心血管疾病病理?yè)p害的主要機(jī)制。在缺血后再灌注的頭幾分鐘，細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高，氧化自由基大量生成和無(wú)機(jī)磷離子濃度增加，促使線粒體內(nèi)膜上形成大量非特異性的通透轉(zhuǎn)換孔(Mitochondrial permeability transition pore，mPTP)，使線粒體內(nèi)膜喪失屏障作用，大量溶質(zhì)分子進(jìn)入線粒體，導(dǎo)致線粒體氧化磷酸化脫偶聯(lián)、基質(zhì)腫

2、脹、膜電位下降和線粒體崩解，當(dāng)受累的線粒體數(shù)量與程度達(dá)到一定閾值，便會(huì)發(fā)生細(xì)胞死亡。盡管有大量關(guān)于mPTP的研究，究竟mPTP的分子身份是什么，到目前為止還不清楚。當(dāng)前研究發(fā)現(xiàn)同屬于線粒體溶質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)體家族(Solute carriers，SLCs)的磷轉(zhuǎn)運(yùn)體(Phosphate carrier，PiC)和腺嘌呤核苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(ADP/ATP translocase，ANT)可能參與了mPTP的形成。利用序列比對(duì)結(jié)合種系發(fā)生分析，發(fā)現(xiàn)線粒體溶

3、質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)體家族成員中存在序列及結(jié)構(gòu)相似較高成員谷氨酸-天冬氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(Aspartate/glutamatecarriers，AGC)和ATP-Mg/Pi轉(zhuǎn)運(yùn)體(ATP-Mg/Pi carriers)，推測(cè)其可能參與了mPTP的形成和開放。
　　 目的：闡明mPTP的分子身份；揭示mPTP各成員在細(xì)胞死亡的作用。
　　 方法：利用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)SLCs成員的表達(dá)亞型并作為研究對(duì)象，進(jìn)一步通過(guò)RNAi干擾技術(shù)對(duì)初步篩選

4、的線粒體溶質(zhì)運(yùn)載體家族的PiC、ANT、AGC與ATP-Mg/Pi轉(zhuǎn)運(yùn)體進(jìn)行了逐一和聯(lián)合干擾，用1.8mM/L鈣離子和5μMIonomycin刺激1小時(shí)后，Western-blotting檢測(cè)細(xì)胞色素c釋放。采用同樣的干擾和刺激方法檢測(cè)細(xì)胞死亡數(shù)目的變化，進(jìn)一步用TMRM檢測(cè)線粒體膜電位的變化。
　　 結(jié)果：RNAi干擾H9c2細(xì)胞系和新生大鼠心肌細(xì)胞中的PiC、ANT2和ATP-Mg/Pi均能顯著降低高鈣誘導(dǎo)的細(xì)胞色素c的釋放

5、，而RNAi干擾ANT1和AGC后細(xì)胞色素c的釋放量同對(duì)照組相比沒有明顯變化。同樣，RNAi干擾H9c2細(xì)胞系和新生大鼠心肌細(xì)胞中的PiC、ANT2和ATP-Mg/Pi后，可以顯著降低高鈣誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，而且H9c2細(xì)胞系模擬缺血再灌注的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，干擾上述SLC25A家族成員，可使線粒體膜電位保持較高水平。
　　 結(jié)論：PiC、ANT2和ATP-Mg/Pi均參與了高鈣誘導(dǎo)的mPTP的形成和開放，RNAi干擾這些成員會(huì)降低細(xì)胞