大鼠肝臟再生時線粒體通透性轉換與蛋白釋放關系的研究.pdf

1、創(chuàng)傷和各種肝病后，殘存肝組織很快會進入復雜的再生過程。研究肝再生分子機理必將對肝臟移植、創(chuàng)傷、各種肝病及肝腫瘤診治具有重要意義。但是目前對肝再生的分子機理，尤其是肝再生啟動和終止的機制仍不清楚。而能量代謝的調控始終是肝細胞再生過程中的重要環(huán)節(jié)，線粒體不僅為細胞生命活動提供所需的能量，而且直接參與細胞內許多信號轉導過程。許多研究表明線粒體通透性轉換(mitochondrialpermeabilitytransition,MPT)是這一切功

2、能的重要環(huán)節(jié)，與細胞許多生命活動(增殖、腫瘤、凋亡、損傷和衰老等)有關。 近年來的一些研究發(fā)現肝再生過程中尤其是在早期(0-24h)MPT有一些明顯特征性的變化。GrecoM等在1998年發(fā)現一些線粒體基質酶不同程度的釋放到胞液中，GuerrieriF等在2002年發(fā)現早期線粒體的超微結構顯著變化，我們課題組在2004年通過離體實驗發(fā)現在肝再生的早期和后期線粒體的通透性均明顯增加。而這些變化與肝再生的關系如何目前還不清楚，尤其是

3、與肝再生的啟動和終止的關系目前還沒有進一步的研究。鑒于上述分析，本課題利用經典的大鼠肝再生模型(partialhepatectomy，PH)，并用線粒體通透性轉換的專一性抑制劑環(huán)胞菌素A(cyclosporin-A，CsA)干擾和影響肝再生過程，觀察肝再生情況和在體線粒體超微結構變化，系統(tǒng)研究肝再生過程中MPT的變化及其功能意義，包括自由基、線粒體基質蛋白釋放以及細胞凋亡的變化，并用蛋白組學的方法研究肝再生早期線粒體的蛋白質釋放譜，為更

4、好的闡明肝細胞再生的分子機理提供實驗依據。 一、肝再生過程中肝再生情況和線粒體超微結構的變化為了在體觀察肝再生過程中線粒體通透性轉換的變化規(guī)律，我們觀察了肝再生度和再生指數的變化，在體線粒體的超微結構變化以及CsA對其的影響。結果發(fā)現在PH后24h時肝臟的體積和體質量開始有明顯的變化，然后逐漸升高，到168h時達到峰值，而CsA組在PH后72h時的肝再生度和再生指數明顯低于PH組，其他時間兩組之間無顯著差別。 透射電鏡顯

5、示在PH后24h時線粒體發(fā)生重度腫脹，線粒體明顯增大變圓，基質變淡，甚至完全空泡化，嵴明顯縮短甚至消失；72h時中度腫脹，6h、120h時輕度腫脹，而內質網也有類似的變化；0h、3h、168h時基本正常。CsA組在0、3、6h時輕度腫脹，24h中度腫脹，72h和168h時則明顯收縮，早期線粒體的腫脹可能與CsA對肝臟的毒性作用有關，后期的收縮可能與CsA對線粒體的通透性轉換抑制有關。 二、肝再生過程中自由基含量的時相變化活性氧族

6、與抗氧化系統(tǒng)在細胞再生和分化過程中具有重要調控作用，同時自由基與MPT是互為因果關系。我們測定了肝再生過程中肝組織中丙二醛(malondialdehyde，MDA)的變化，發(fā)現在PH后3h時輕度升高，到24h時達到最高，之后逐漸下降，到120h時恢復正常。CsA組MDA的變化規(guī)律與PH組的基本一致，但在(0-120h)的各個時間點自由基含量明顯高于PH組。 三、肝再生過程中線粒體和胞液中AST和GDH酶活性的時相變化上述線粒體超

7、微結構的改變是否會伴有線粒體蛋白的釋放?我們系統(tǒng)研究了肝再生過程中線粒體基質蛋白天冬氨酸轉移酶(aspartateaminotransferase，AST)和谷氨酸脫氫酶(glutamicaciddehydrogenase，GDH)的酶活性，以及CsA對其的影響。發(fā)現胞液中的mAST和GDH在PH后3h升高，到24h時都達到最高峰，到120h恢復正常，同時線粒體內的這兩種酶活性則相應降低。CsA組在0h和3h時胞液中的這兩種酶活性顯著高

8、于PH組，在24h、48h和72h時則顯著低于PH組，后期恢復正常。肝再生過程中這兩種線粒體基質酶的釋放情況與線粒體超微結構的變化規(guī)律基本一致，暗示了肝再生過程中線粒體通透性轉化與蛋白質釋放相關。 四、肝再生過程中肝caspase-3和caspase-8活性的時相變化為了進一步研究肝再生過程中細胞凋亡的變化規(guī)律和探討肝細胞凋亡活性的變化與MPT之間的關系，我們測定了肝再生過程中肝細胞凋亡蛋白酶caspase-3和caspase-

9、8活性變化，結果發(fā)現在PH組3h和6h時caspase-3活性在出現短暫性的升高，到72h顯著性升高，到168h時升高最明顯；在CsA組，caspase-3活性在3h時達到峰值，顯著高于PH組，之后逐漸下降，而后期(72-168h)則顯著低于PH組，但仍高于SH組。caspase-8活性在0h時CsA組顯著高于PH組和SH組，在3h時三個組都同時升高，但CsA組顯著高于PH組和SH組，在168h時PH組顯著高于CsA組和SH組，其他時間

10、三組無顯著差異。表明肝再生早期細胞凋亡活性的升高可能與術后應激和外源性途徑激活有關，而后期的明顯升高可能與線粒體途徑有關，但具體機制仍需進一步研究。 五、肝再生過程中線粒體的釋放蛋白圖譜本課題研究和其他研究都表明在PH后24h時線粒體的超微結構變化和基質蛋白釋放最明顯，但線粒體釋放的哪些蛋白仍不清楚。我們用肝再生24h和SH組的肝組織分離的線粒體進行體外孵育，用二維電泳和質譜技術，研究了線粒體蛋白釋放的差異。結果發(fā)現在二維電泳凝

11、膠中共有60個左右的蛋白質點，選定了3個明顯差異的蛋白質作質譜分析，分別為：鈣網硬蛋白、精氨酸酶I和一個預測蛋白Tpr(translocatedpromoterregion)。Tpr的功能目前不清楚，其余2個都與肝細胞的蛋白質和DNA合成增加有關。 結論1、肝再生過程中線粒體超微結構的變化與肝再生的發(fā)生和發(fā)展有一定的相關性，尤其在24h時變化最顯著，此時肝臟的體積和體質量開始顯著增加，這種變化可能與肝再生的啟動有密切關。

12、 2、肝再生過程中自由基變化和線粒體基質蛋白釋放與線粒體超微結構的變化規(guī)律基本一致，提示自由基變化和線粒體基質蛋白釋放可能與MPT相關。 3、肝再生過程中早期細胞凋亡活性的短暫性升高可能與術后應激反應和外源性途徑有關，而后期的顯著升高可能與線粒體途徑有關。 4、CsA在體介入影響肝再生過程，進一步佐證上述變化與MPT相關。 5、在PH后24h時肝組織線粒體體外誘導后的上清，經過雙向電泳和質譜分析，發(fā)現3種明顯差異