水稻小穗發(fā)育相關(guān)基因MES1的圖位克隆與功能分析.pdf

1、水稻(OryzasativaL.)是世界上重要的糧食作物，也是單子葉植物的模式植物。水稻是研究花發(fā)育的理想材料，與雙子葉模式植物相比，水稻花序具有禾本科植物獨(dú)有的結(jié)構(gòu)單元—小穗，而且具有豐富的遺傳與基因組資源。深入研究水稻生殖發(fā)育過(guò)程，不僅有助于深入理解水稻小穗或小花的形成機(jī)制，而且對(duì)豐富植物發(fā)育生物學(xué)知識(shí)和提高水稻產(chǎn)量都具有重要意義。
　　 在本研究中，克隆了一個(gè)水稻小穗發(fā)育相關(guān)基因MULTI-FLORETSPIKELETI(

2、MFS1)，我們對(duì)其進(jìn)行了表型和細(xì)胞學(xué)觀察，表達(dá)模式分析以及功能驗(yàn)證。主要結(jié)果如下:
　　 1.mfs1突變體表型觀察
　　 從EMS誘變庫(kù)中發(fā)現(xiàn)mfs1-1和mfs1-2兩個(gè)等位小穗突變體，相比而言mfs1-1突變表型更嚴(yán)重和豐富，以下主要描述mfs1-1突變體。開(kāi)花期的mfs1-1小穗護(hù)穎退化類似于副護(hù)穎，小穗軸伸長(zhǎng)，形成額外的外稃，內(nèi)稃主體部分退化，內(nèi)三輪的花器官?zèng)]有發(fā)現(xiàn)同源轉(zhuǎn)化現(xiàn)象但花器官數(shù)目不確定。掃描電鏡顯示

3、，早期護(hù)穎原基發(fā)育遲緩和退化，部分小花形成擴(kuò)大的花分生組織和兩個(gè)退化的內(nèi)稃原基，雄蕊發(fā)育不同步。
　　 2.MFS1遺傳分析與分子定位
　　 利用三個(gè)雜交組合進(jìn)行遺傳分析和分子定位，雜交F1代植株表型與野生型相似，F(xiàn)2代植株發(fā)生分離，正常株和突變株分離比均符合3∶1，表明MFS1基因受單隱性基因控制。運(yùn)用SSR標(biāo)記和InDel標(biāo)記進(jìn)行基因定位，MFS1基因被最終定位在第5染色體InDel17和InDel24之間。

4、　　 3.MFS1基因的克隆與蛋白質(zhì)分析
　　 DNA和cDNA測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)一個(gè)編碼APETALA2/EREBP結(jié)構(gòu)域蛋白的基因Os05941760分別在mfs1-1和mfs1-2突變體中存在一個(gè)C-T的替換，引起了氨基酸的改變，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的功能變異，初步確定其為候選基因。MFS1屬于AP2/ERF家族中一個(gè)功能未知的分支，蛋白質(zhì)定位在細(xì)胞核內(nèi)。
　　 4.MFS1基因的表達(dá)模式分析
　　 利用半定量RT-PC

5、R，qPCR和原位雜交技術(shù)進(jìn)行了表達(dá)模式分析。半定量RT-PCR和qPCR結(jié)果顯示MFS1基因在根，莖，葉和花中都表達(dá)，尤其在花序早期表達(dá)強(qiáng)烈。原位雜交顯示MFS1在分生組織和護(hù)穎原基中表達(dá)強(qiáng)烈，隨著花器官的發(fā)育，表達(dá)量逐漸減弱。
　　 5.MFS1基因的功能驗(yàn)證
　　 構(gòu)建MFS1基因的基因組互補(bǔ)載體，轉(zhuǎn)化mfs1-1突變體的愈傷組織，獲得轉(zhuǎn)基因植株，通過(guò)GUS染色檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植株。結(jié)果表明，mfs1-1突變體表型完全恢

6、復(fù)，確定了Os05941760基因是MFS1基因。mfs構(gòu)建MFS1基因的RNAi轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化秈稻品種縉恢10號(hào)和粳稻品種中花11的愈傷組織，獲得轉(zhuǎn)基因植株，GUS染色、PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植株。RNAi轉(zhuǎn)基因植株小穗表現(xiàn)為護(hù)穎退化，小穗軸伸長(zhǎng)，額外的外稃狀器官和內(nèi)稃退化，與mfs1突變體的表型高度相似，進(jìn)一步證明了Os0Sg41760基因是MFS1基因和MFS1基因的功能。
　　 6.MFS1調(diào)控其它花發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)<