水稻穗頂部穎花退化基因PAA1的圖位克隆與功能分析.pdf

1、水稻是重要的糧食作物，為全球大約一半的人口提供主食。水稻每穗粒數(shù)是構(gòu)成產(chǎn)量的重要因素之一。穗大粒多一直是世界水稻育種的主要目標(biāo)，然而水稻穗頂部穎花退化現(xiàn)象在水稻育種中普遍發(fā)生，造成穗子體積減小每穗粒數(shù)顯著減少，嚴(yán)重影響水稻單產(chǎn)。目前，關(guān)于水稻穗頂部小穗退化的遺傳和分子機(jī)制還知之甚少。本研究以水稻組織培養(yǎng)過程中獲得的穗頂部退化突變體paa1為材料，并對(duì)頂部穎花發(fā)生退化的整個(gè)過程進(jìn)行了詳細(xì)的觀察，通過圖位克隆的方法分離并鑒定了一個(gè)影響水稻穗

2、頂部退化的關(guān)鍵因子PAA1，并對(duì)該基因的功能進(jìn)行深入的研究，揭示了paa1發(fā)生穗頂部穎花退化的分子機(jī)制。本文主要研究結(jié)果如下
　　1、與野生型相比，突變體paa1在營養(yǎng)生長時(shí)期沒有出現(xiàn)明顯的表型差異，抽穗以后，突變體的穗頂部小穗發(fā)生嚴(yán)重退化，并且穗一直保持直立的形態(tài)。籽粒成熟之后，突變體paa1頂部退化的小穗幾乎都脫落，導(dǎo)致穗長、穗粒數(shù)、千粒重以及株高顯著降低，最終對(duì)paa1的單株產(chǎn)量造成影響。
　　2、不同發(fā)育階段幼穗形態(tài)

3、的觀察結(jié)果表明paa1的頂部小穗在幼穗伸長后期出現(xiàn)生長停滯，然后逐漸表現(xiàn)為干癟和發(fā)白。細(xì)胞學(xué)觀察表明paa1項(xiàng)部退化小穗表現(xiàn)為細(xì)胞皺縮、細(xì)胞器降解以及染色體DNA斷裂。paa1頂部小穗中過氧化氫和丙二醛含量均顯著升高，誘發(fā)細(xì)胞程序性死亡的基因Os VPE2和OsVPE3的表達(dá)水平顯著上調(diào)，說明paa1頂部小穗的退化是由于過氧化氫積累引發(fā)的細(xì)胞程序性死亡造成的。
　　3、利用圖位克隆的方法將PAA1精細(xì)定位在第2號(hào)染色體長臂端的標(biāo)記

4、C1和H-4之間82kb的范圍內(nèi)，含9個(gè)ORFs，測序發(fā)現(xiàn)第6個(gè)ORF(LOC_Os02g45160)的第2個(gè)內(nèi)含子與第3個(gè)外顯子的剪切位點(diǎn)上發(fā)生了堿基A→G的替換，結(jié)果導(dǎo)致mRNA的剪切發(fā)生改變，從而形成了兩種異常的轉(zhuǎn)錄本，都會(huì)造成蛋白質(zhì)翻譯時(shí)發(fā)生移碼并提前終止。轉(zhuǎn)基因互補(bǔ)和干擾實(shí)驗(yàn)都可以確定LOC_Os02g45160是引起穗頂部退化的目標(biāo)基因PAA1。PAA1基因編碼一個(gè)鋁激活的蘋果酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，屬于水稻ALMT家族的成員。PAA1

5、定位在細(xì)胞質(zhì)膜上，在水稻的根、莖、葉、葉鞘和穗等各個(gè)組織中都有不同程度的表達(dá)。
　　4、PAA1在二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)缺陷型菌株中表達(dá)可以吸收蘋果酸，說明PAA1在大腸桿菌中具有蘋果酸轉(zhuǎn)運(yùn)功能。利用雙電極電壓鉗技術(shù)可以在表達(dá)PAA1的卵母細(xì)胞中檢測到明顯的蘋果酸電流，A1處理后對(duì)電流沒有影響，說明PAA1在卵母細(xì)胞中是一個(gè)不依賴于A1的蘋果酸通道。外源蘋果酸處理水稻幼苗后，PAA1的表達(dá)水平顯著上調(diào)，paa1地上部的蘋果酸含量顯著降低。孕穗

6、時(shí)期，蘋果酸含量測足結(jié)果表明paa1頂部小穗中的蘋果酸積累量顯著減少，外源蘋果酸注射突變體幼穗能顯著減弱頂部退化表明突變體頂部小穗的退化是由蘋果酸含量降低引起的。
　　5、水稻幼穗中NAD(H)和NADP(H)含量測定結(jié)果顯示，paa1頂部小穗細(xì)胞內(nèi)的NADPH、NADP+和NAD+含量與野生型相比都顯著降低，同時(shí)，NADPH/NADP+比率顯著降低，而NADH/NAD+比率顯著升高。這些結(jié)果說明突變體頂部小穗細(xì)胞內(nèi)蘋果酸含量的降