水稻長葉毛基因Hairy Leaf6的圖位克隆與功能分析.pdf

1、表皮毛是一種由植物表皮細胞特化形成的組織，廣泛分布于各種植物的表面。表皮毛可以在植物表皮形成一層物理屏障，幫助植物抵御病蟲的侵害、疏散葉片表面的熱量、減少紫外線的輻射傷害以及降低水分的蒸騰速率，對植物抵御各種逆境和脅迫具有積極的作用。表皮毛作為一種細胞的特殊形態(tài)，是研究細胞生長發(fā)育和分化等生物學(xué)過程的經(jīng)典模式，在擬南芥中進行了廣泛的研究;水稻作為單子葉模式植物，以往的研究多集中于株型、產(chǎn)量、品質(zhì)以及抗性等方面，對表皮毛的研究較少。為了解

2、析調(diào)控水稻表皮毛生長發(fā)育的遺傳基礎(chǔ)和分子機制，本研究利用關(guān)聯(lián)分析和連鎖分析的方法研究了調(diào)控水稻葉片表皮毛性狀的遺傳基礎(chǔ)，圖位克隆了控制長毛葉表型的關(guān)鍵基因HL6，并研究了其功能，提出了水稻表皮毛發(fā)育的分子調(diào)控模型，得到的主要結(jié)果如下:
　　1.對253份核心種質(zhì)的葉毛表型進行調(diào)查發(fā)現(xiàn)水稻種質(zhì)中存在3種葉毛表型:光滑、短毛和長毛。利用50K的SNP芯片基因型進行葉毛性狀的全基因組關(guān)聯(lián)分析，在第6染色體上檢測到2個與長毛表型顯著關(guān)聯(lián)的

3、位點，對2個候選基因Loc_Os06g44300和Loc_Os06g44320進行超量表達，結(jié)果顯示這2個基因的轉(zhuǎn)基因植株的表皮毛都沒有明顯的變化，表明可能由其他的基因調(diào)控水稻種質(zhì)中葉毛表型的變異。
　　2.對長毛品系W39與短毛品種ZS97構(gòu)建的F2群體分析發(fā)現(xiàn)葉片長毛表型由單位點顯性基因控制;利用BSA方法將控制長毛表型的基因初步定位到第6染色體上，命名為Hairy Leaf6(HL6)，進一步將HL6精細定位到S5至S9的5

4、5kb區(qū)間內(nèi)，互補轉(zhuǎn)化的結(jié)果表明Loc_Os06g44750就是HL6基因。序列比對顯示雙親間HL6的啟動子和編碼區(qū)都存在變異，導(dǎo)致HL6的表達水平和氨基酸序列都存在差異。通過互補載體的啟動子替換以及不同HL6等位基因的超表達轉(zhuǎn)化發(fā)現(xiàn)由啟動子調(diào)控的HL6的轉(zhuǎn)錄水平對調(diào)控表皮毛的伸長具有主要作用，而蛋白結(jié)構(gòu)的變化對表皮毛的伸長沒有明顯的影響。
　　3.HL6編碼含有1個AP2結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子，定位于細胞核，通過C端發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活的功能

5、。同源分析顯示HL6與擬南芥控制子葉異位表皮毛形成的EMBRYOMAKER蛋白關(guān)系最近，表明AP2蛋白在調(diào)控單子葉和雙子葉植物表皮毛發(fā)育的過程中可能具有保守的功能。
　　4.激素處理發(fā)現(xiàn)HL6ZS97的表達受生長素的輕微抑制，而HL6W39受到大約2倍的誘導(dǎo);分析發(fā)現(xiàn)位于HL6啟動子-2375位的A/C SNP和-2361位的19bpINDEL會造成HL6ZS97啟動子中的2個生長素反應(yīng)元件發(fā)生突變，導(dǎo)致OsARF25不能與這2個

6、生長素反應(yīng)元件互作，引起了HL6W39和HL6ZS97對生長素的不同反應(yīng)，進而導(dǎo)致了表達水平的差異。
　　5.對長毛品系W39和光葉品種LEMONT構(gòu)建的F2群體分析發(fā)現(xiàn)控制長毛表型的HL6與控制光葉表型的Os WOX3B存在遺傳互作，HL6調(diào)控的長毛表型依賴于有功能的Os WOX3B。EMSA和酵母單雜交的結(jié)果顯示OsWOX3B通過結(jié)合HL6的啟動子直接調(diào)控HL6的轉(zhuǎn)錄。雙分子熒光互補實驗(BiFC)、酵母雙雜交和體外蛋白質(zhì)結(jié)合

7、分析的結(jié)果顯示HL6與OsWOX3B之間也存在蛋白互作，通過AP2和HD結(jié)構(gòu)域形成蛋白復(fù)合體，共同調(diào)控OsYUCCA5、OsPINla、OsARF4和OsARF7的表達，影響生長素的含量和分布。HL6和OsWOX3B可以直接結(jié)合OsYUCCA5從而調(diào)控其表達，并且HL6與OsWOX3B之間的蛋白互作可以增強HL6蛋白與OsYUCCA5的結(jié)合能力。
　　6.高溫處理和失水速率的結(jié)果表明HL6控制的長毛表型可以提高水稻幼苗對高溫的抗性

8、，降低葉片水分的蒸騰速率，對提高水稻的抗旱能力具有積極的作用;產(chǎn)量性狀的考察結(jié)果顯示HL6對水稻的產(chǎn)量有一定的抑制作用。
　　7.單倍型分析發(fā)現(xiàn)HL6在種質(zhì)中至少有10種單倍型，其中控制長毛表型的HL6W39所在單倍型H10的頻率非常稀少。栽培稻中HL6的核酸多樣性只有野生稻的1/10，Tajima's D以及其他檢驗的結(jié)果顯示HL6在秈稻中顯著的偏離了中性進化的期望值，表明秈稻中控制長毛表型的HL6W39來源于野生稻，在水稻馴化