菊花‘神馬’花芽分化期的數(shù)字基因表達(dá)譜及關(guān)鍵基因的克隆和表達(dá)分析.pdf

1、菊花（Chrysanthemum morifolium Ramat.）是菊科(Asteraceae)菊屬(Chrysanthemum)植物，是世界四大鮮切花之一。栽培品種3000多個(gè)，用于切花菊的品種多為典型的短日照植物，光周期途徑調(diào)控開(kāi)花主要由光受體基因接受光信號(hào)，傳遞給節(jié)律鐘基因，通過(guò)節(jié)律鐘調(diào)控輸出基因激活下游轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，在葉中上調(diào)促進(jìn)開(kāi)花基因的表達(dá)，輸送到莖尖與成花整合因子作用完成花芽分化。
　　 本研究以白色切花菊‘

2、神馬’為試材，因其典型的短日照特點(diǎn)，能較準(zhǔn)確人工調(diào)控花芽分化進(jìn)程，是研究菊花花芽分化分子機(jī)理的模式材料。通過(guò)大規(guī)模高通量測(cè)序，獲得數(shù)據(jù)與NCBI核酸蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，經(jīng)生物信息分析，確定功能分類及涉及的代謝途徑，獲得菊花花芽分化期相關(guān)的基因表達(dá)信息，探索在菊花不同花芽分化階段相關(guān)基因的差異表達(dá)富集模式及表達(dá)譜;對(duì)光周期途徑的關(guān)鍵基因進(jìn)行全長(zhǎng)的克隆與表達(dá)分析，在分子水平上對(duì)菊花開(kāi)花時(shí)間的網(wǎng)絡(luò)途徑有初步的了解，為后期進(jìn)一步進(jìn)行基因的功能驗(yàn)

3、證及通過(guò)分子育種方法（反義抑制或轉(zhuǎn)基因）培育目標(biāo)花期新品種提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。
　　 本研究主要成果如下:
　　 1.本試驗(yàn)獲得菊花花芽分化期轉(zhuǎn)錄組ESTs，對(duì)所有unigenes進(jìn)行功能分類，收集到54，488條分屬于分子功能、細(xì)胞組分和生物學(xué)過(guò)程的unigenes。其中參與分子功能的共12種，參與細(xì)胞組分的共11種，參與生物學(xué)過(guò)程的共18種。得到編碼蛋白框(CDS)的核酸序列和氨基酸序列為54，644條。用ESTsca

4、n比對(duì)所有unigenes，得到其CDS的核酸序列和氨基酸序列均為8，506條。將所有unigenes與COG數(shù)據(jù)庫(kù)BLAST比對(duì)顯示，共獲得22，871條與已知其他植物同源，屬于23類直系同源簇群，未知功能的有780條;得到25，001條參與代謝通路的unigenes，從中收集到與植物節(jié)律代謝通路相關(guān)unigenes共269條，從中比對(duì)到參與光周期途徑的光受體基因、生物節(jié)律鐘基因和生物節(jié)律鐘輸入和輸出基因等相似功能基因共20個(gè)。

5、>　　 2.初步得出菊花花芽分化期涉及植物節(jié)律途徑的數(shù)字基因表達(dá)譜:
　　 菊花光受體HYB在花芽分化啟動(dòng)期表達(dá)量達(dá)最高值，是暗處理前的近五倍，隨后稍有下降，到總苞鱗片分化中期仍維持暗處理前的近三倍，到分化完成一直還維持近兩倍的表達(dá)量;
　　 節(jié)律鐘組件APRS、TOC1表達(dá)高峰值均出現(xiàn)在總苞鱗片分化中期;PIF3高峰值出現(xiàn)在花芽分化啟動(dòng)期，到總苞鱗片分化中期仍維持暗處理前的近三倍;FKF1在花芽分化啟動(dòng)期上調(diào)到高峰值

6、，總苞鱗片分化中期下調(diào)表達(dá)，隨后在小花原基分化中期和分化完成期又上調(diào)到高峰。
　　 節(jié)律鐘輸出基因GI在花芽分化啟動(dòng)期表達(dá)量達(dá)最高值，在總苞鱗片分化中期稍有下降，分化完成期又有回升。
　　 CO暗處理一天后反而表達(dá)量降低，在總苞鱗片分化中期表達(dá)量達(dá)最高值。
　　 CHS（查爾酮合成酶）在暗處理一天后表達(dá)量上調(diào)，啟動(dòng)期達(dá)近五倍的最高值，總苞鱗片分化中期表達(dá)量稍下降，隨后在小花原基分化中期下調(diào)表達(dá)。
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7、.初步得出菊花花芽分化期差異表達(dá)基因顯著富集的最主要生化代謝途徑和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑:集中在光合作用及核蛋白體途徑中。
　　 4.初步得出菊花不同花芽分化階段差異表達(dá)基因富集參與的生物功能:
　　 花芽未分化期，植物中蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶家族基因和蛋白參與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控、氧化還原酶活性基因轉(zhuǎn)錄加強(qiáng);花芽分化啟動(dòng)期，脂肪酸合成酶、糖氫共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性基因差異表達(dá)富集，蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶的差異表達(dá)顯著;總苞鱗片分化中期，信息顯示

8、富集在各種蛋白質(zhì)、核苷酸糖的合成;小花原基分化中期，蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶活性加強(qiáng)，氧化還原酶活性基因轉(zhuǎn)錄加強(qiáng);花冠分化末期即花芽分化完成期，基因差異表達(dá)富集仍在結(jié)構(gòu)分子活動(dòng)、砷酸鹽還原酶活性和作為花和花粉發(fā)育的能量來(lái)源的脯氨酸的累積等方面。
　　 5.從菊花‘神馬’中克隆得到節(jié)律鐘輸出基因GIGANTEA的cDNA全長(zhǎng)序列，命名為CmGI基因，登錄號(hào)為JQ043439。對(duì)其做序列信息分析;菊花CmGI的表達(dá)呈晝夜節(jié)律表達(dá)模式，

9、高峰值出現(xiàn)在16:00;不同花芽分化階段葉片中CmGI基因mRNA水平差異大，兩個(gè)高峰值分別出現(xiàn)在花芽分化啟動(dòng)期和小花原基分化中期;盛花期表達(dá)量較高。
　　 6.從菊花‘神馬’中克隆得到開(kāi)花相關(guān)基因CmCOL的cDNA全長(zhǎng)序列，登錄號(hào)為KC589293，對(duì)其做序列信息分析;菊花CmCOL mRNA在葉中高表達(dá)，呈晝夜節(jié)律表達(dá)模式，表達(dá)高峰值出現(xiàn)在04:00;短日照處理能上調(diào)葉中CmCOL，對(duì)芽中的影響不明顯;不同花芽分化階段葉片

10、中高峰值出現(xiàn)在小花原基分化中期;盛花期葉片中高表達(dá)。
　　 7.菊花CmFTL mRNA只在短日照條件下的葉片中呈現(xiàn)節(jié)律表達(dá)，00:00時(shí)為高峰值;芽中及長(zhǎng)日照葉、芽中均檢測(cè)不到晝夜起伏;不同花芽分化階段葉片中CmFTLmRNA水平差異大，小花原基分化中期達(dá)最高峰值;花蕾期葉中高表達(dá)。
　　 8.研究顯示菊花葉片感應(yīng)光周期，短日照條件下CmGI首先于暗處理1d后啟動(dòng)上調(diào)，花芽分化啟動(dòng)期出現(xiàn)第一個(gè)峰值，而CmCOL則滯后C