中華絨螯蟹的基因表達(dá)譜及生殖相關(guān)基因的克隆、表達(dá)模式研究.pdf

1、中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)是中國淡水漁業(yè)的重要組成部分，它已經(jīng)成為中國的一道傳統(tǒng)美食。由于它肉質(zhì)細(xì)嫩，味道鮮美，營養(yǎng)豐富，在全球市場供不應(yīng)求且價(jià)格不菲。它是我國重要的經(jīng)濟(jì)水產(chǎn)養(yǎng)殖品種，該蟹的養(yǎng)殖已成為我國水產(chǎn)養(yǎng)殖的支柱產(chǎn)業(yè)。在過去的幾十年中，隨著密集化養(yǎng)殖的發(fā)展，由細(xì)菌、病毒和類立克次氏體屬微生物所引發(fā)的各種疾病，以及性早熟、個(gè)體小型化以、種質(zhì)退化等現(xiàn)象在中華絨螯蟹種群中頻頻發(fā)生，并且對(duì)螃蟹的質(zhì)量造成災(zāi)難性損失，

2、已經(jīng)成為限制該蟹養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的重要瓶頸。因此認(rèn)為了解其免疫防御機(jī)制、免疫因子特征，以及生殖生物學(xué)尤其是生殖的分子機(jī)理的研究，對(duì)螃蟹養(yǎng)殖的疾病控制和健康管理很有幫助，并為該蟹養(yǎng)殖過程中的人工生殖調(diào)控提供理論保障。本論文試圖從分子角度來研究中華絨螯蟹的免疫防御機(jī)制以及雄性生殖機(jī)理，以期能有效突破中華絨螯蟹人工養(yǎng)殖的瓶頸，進(jìn)一步促進(jìn)該蟹養(yǎng)殖業(yè)的持續(xù)發(fā)展。
　　 本研究借助分子生物學(xué)和生物信息學(xué)手段，首次完成對(duì)中華絨螯蟹肝胰腺cDNA文庫

3、的構(gòu)建和表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)的分析，并利用先進(jìn)的Solexa測序技術(shù)，對(duì)中華絨螯蟹副性腺組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組及microRNA的大規(guī)模測序并分析其基因表達(dá)情況。不僅豐富了中華絨螯蟹的基因組數(shù)據(jù)庫，同時(shí)篩選出許多免疫相關(guān)及生殖相關(guān)的的基因序列。通過對(duì)所測高通量數(shù)據(jù)分析的注釋結(jié)果，結(jié)合已有物種生殖相關(guān)基因的研究現(xiàn)狀，分析、篩選與該蟹生殖發(fā)育相關(guān)的部分重要基因；利用RACE和WORKING等技術(shù)，獲得這些基因的cDNA全長以及基因的結(jié)構(gòu)；利用re

4、altime PCR研究不同基因在不同組織中以及同一組織不同發(fā)育階段的表達(dá)情況，探討這些基因在整個(gè)生殖發(fā)育過程中的調(diào)控作用。這些研究為了解中華絨螯蟹生殖機(jī)制提供了基礎(chǔ)資料，同時(shí)也為深入探討該蟹雄性生殖機(jī)理提供了重要的參考。主要研究結(jié)果如下：
　　 1采用常規(guī)cDNA文庫構(gòu)建技術(shù)，成功構(gòu)建了一個(gè)中華絨螯蟹肝胰腺的EST文庫并且獲得了3，279高質(zhì)量序列，代表著1177個(gè)一致性序列。超過一半的一致性序列被鑒定是這一物種的未知的新基因

5、。有很大一部分一致性序列(49％)在新發(fā)布的數(shù)據(jù)庫中找到它們的同源物，這些同源物對(duì)于進(jìn)一步的功能研究很重要?？偨Y(jié)了與代謝和免疫相關(guān)的基因，借以考察肝胰腺的兩種重要功能：代謝和免疫。為中華絨螯蟹的深入研究打下基礎(chǔ)，包括轉(zhuǎn)錄組、物理圖譜和整個(gè)基因組測序。展示了中華絨螯蟹與免疫密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄組和基因的重要性質(zhì)。本文重點(diǎn)找到了與機(jī)體免疫相關(guān)的基因，分為5大類，包括蛋白酶類、抗菌肽、壓力蛋白、抗氧化蛋白和其它與免疫相關(guān)的基因進(jìn)行重點(diǎn)分析。蛋白酶類

6、和他們的抑制劑在無脊椎動(dòng)物抗感染反應(yīng)中的重要性越來越明顯。它們可能在應(yīng)對(duì)侵染性蛋白的體液免役反應(yīng)過程中表達(dá)，這些侵染性蛋白是由侵染性抗原產(chǎn)生的。文庫中發(fā)現(xiàn)了1種抗菌肽，抗脂多糖因子。壓力蛋白
　　 包括鐵蛋白、金屬硫蛋白、熱激蛋白70、胞溶質(zhì)蛋白A。硒與谷胱甘肽系統(tǒng)在抗氧化防御體系。以及β-1，3-葡聚糖結(jié)合蛋白、C型凝集素、血藍(lán)蛋白、干擾素等，都對(duì)中華絨螯蟹的免疫有著重要作用。
　　 2從雄性中華絨螯蟹的副性腺組織中提

7、取并分離mRNA，經(jīng)超聲破碎和隨機(jī)引物反轉(zhuǎn)成cDNA片段，利用Solexa測序(sequencing by synthesis)技術(shù)，對(duì)這些組織的RNA轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行全面測序；用生物信息學(xué)的手段和方法，對(duì)測序數(shù)據(jù)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄譜分析，分析各組織的基因表達(dá)情況，進(jìn)一步綜合各組織之間基因表達(dá)的相關(guān)性，探討不同組織在該蟹雄性生殖過程中的作用及調(diào)控模式。共獲得33，221，284條reads，包含2，657，702，720nt堿基，GC含量55.19％。

8、通過軟件組裝拼接得到85，913條contig，將所有contig按序列長度從小到大排序，其中40，977條(47.70％)contig集中在100-200nt的長度.從第一條序列開始累加計(jì)算contig總長，所有contig的總長度為18，750，722。通過對(duì)Unigene的功能注釋，其中有1713條基因條注釋到General function prediction only，注釋上Translation，ribosomal str

9、ucture andbiogenesis有952條基因，與Transcription相關(guān)的有869條Unigene。關(guān)于Posttranslationalmodification，protein turnover，chaperones和Replication，recombination and repair的基因分別有802和789條。KEGG是基因組破譯方面的數(shù)據(jù)庫。附性腺有1704條基因(14.99％)參與Metabolic pat

10、hways，675條基因參與Regulation of actin cytoskeleton。Spliceosome有564(4.96％)條基因參與其中。得到原始小RNA的fq數(shù)據(jù)后，對(duì)其進(jìn)行去接頭，去低質(zhì)量reads，去污染等處理，得到干凈的序列7939380條。統(tǒng)計(jì)小RNA(sRNA)的種類(用unique表示)及數(shù)量(用total表示)，并對(duì)小RNA做長度分布統(tǒng)計(jì)，一般來說，小RNA的長度區(qū)間為18～30nt，通過長度分布的峰我們

11、可以判斷小RNA的種類，miRNA集中在21或22nt，siRNA集中在24nt，piRNA集中在30nt。共有Total sRNAs7939380條，其中miRNA有382650條(4.82％)、rRNA有214013條(2.70％)、snRNA有2573條(0.03％)、snoRNA有563條(0.01％)、tRNA有432171條(5.44％)以及unann有6907410條(87.00％)。共有Unique sRNAs22684

12、84條，其中miRNA有23021條(1.01％)、rRNA有33764條(1.49％)、snRNA有1003條(0.04％)、snoRNA有224條(0.01％)、tRNA有29425條(1.30％)和unann有2181047條(96.15％)。
　　 3生殖相關(guān)蛋白及其功能的研究是當(dāng)前甲殼動(dòng)物生殖生物學(xué)的研究重點(diǎn)之一，許多生殖相關(guān)蛋白及其功能已經(jīng)明確。瘦素受體在生殖發(fā)育過程有調(diào)節(jié)生殖發(fā)育的作用。本研究根據(jù)EST提供的信息，

13、采用RACE技術(shù)成功克隆了中華絨螯蟹瘦素受體蛋白(EsLEPR)cDNA全長。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，該基因cDNA全長序列的長度大小1403 bp包括一個(gè)72 bp的5’非翻譯區(qū)(5’UTR)，1929 bp的3’-非翻譯區(qū)(3’UTR)的一個(gè)AATAAA加尾信號(hào)和23 bp的polyA尾，和402 bp的開放閱讀框(ORF)，編碼133個(gè)氨基酸的多肽與預(yù)測分子量14.42kDa和理論等電點(diǎn)為4.46。其基因組DNA序列為3553bp其中

14、有3個(gè)內(nèi)含子和4個(gè)外顯子組成，包含有典型的(GT和AG)二核苷酸內(nèi)含子交界處的結(jié)構(gòu)序列剪接位點(diǎn)。氨基酸序列中有一個(gè)保守區(qū)域：Vacuolar protein sorting55(Vps55)。133個(gè)氨基酸的序列中的保守區(qū)域含有4個(gè)跨膜束片段，分別在第4到第26個(gè)氨基酸，第33到第52，第67到第89，和第101到第123。氨基酸序列的多重比對(duì)結(jié)果顯示與Eriocheir sinensis同源性最高的是(64％)麗蠅蛹集金小蜂(Naso

15、nia vitripennis)。它與非洲爪蛙(Xenopus laevis，63％)、紅鰭東方魨(Takifugurubripes，58％)、人(Homo sapiens，57％)、牛(Bos taurus，57％)、(Rhodnius prolixu，56％)、褐鼠(Rattus norvegicus，55％)、海鞘(Ciona intestinalis，54％)，、獼猴(Macaca mulatta，54％)，、蚜蟲(Acyrth

16、osiphon pisum，48％)和Boltenia villosa，40％都有較高的同源性。采用實(shí)時(shí)定量RT-PCR的方法分析中華絨螯蟹瘦素受體蛋白在不同組織中以β-actin作為內(nèi)參的相對(duì)表達(dá)情況。組織中的表達(dá)分析顯示，中華絨螯蟹瘦素受體蛋白的mRNA在各個(gè)組織中均有表達(dá)，主要是在腸、精巢、胸神經(jīng)節(jié)、腦神經(jīng)節(jié)和肝胰腺等組織中表達(dá)。
　　 4蛻皮激素引起的幼體蛻皮發(fā)育有關(guān)的各種活動(dòng)。蛻皮激素調(diào)節(jié)蛋白可能是甲殼動(dòng)物變態(tài)蛻皮級(jí)聯(lián)

17、反應(yīng)的重要元素。在中華絨螯蟹養(yǎng)殖中性早熟和蛻皮未遂的問題經(jīng)常發(fā)生。這兩種病害與甲殼動(dòng)物的蛻皮是密切相關(guān)的，研究蛻皮相關(guān)基因?qū)τ诮鉀Q中華絨螯蟹性早熟和蛻皮未遂的問題有重要的意義。通過EST分析得到蛻皮激素調(diào)節(jié)蛋白的兩條ESTs(FG358768，F(xiàn)G359773)；用RACE方法得到中華絨螯蟹蛻皮激素調(diào)節(jié)蛋白cDNA全長。中華絨螯蟹蛻皮激素調(diào)節(jié)蛋白基因cDNA全長序列的長度大小1384 bp包括一個(gè)117-bp的5'非翻譯區(qū)(5'UTR)

18、、841-bp的3’-非翻譯區(qū)(3’UTR)的一個(gè)AATAAA加尾信號(hào)和31-bp的polyA尾，和426 bp的開放閱讀框(ORF)，編碼141個(gè)氨基酸的多肽與預(yù)測分子量15，150.3 Da和理論等電點(diǎn)為3.86。中華絨螯蟹蛻皮激素調(diào)節(jié)蛋白的基因組DNA序列為3060bp其中有1個(gè)內(nèi)含子和2個(gè)外顯子組成。中華絨螯蟹蛻皮激素受體基因組序列的包含有典型的(GT和AG)二核苷酸內(nèi)含子交界處的結(jié)構(gòu)序列剪接位點(diǎn)。而且在基因組序列序列與其cDN

19、A序列一致。用ClustalW軟件對(duì)不同物種的蛻皮激素調(diào)節(jié)蛋白的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)。中華絨螯蟹的蛻皮激素調(diào)節(jié)蛋白與Litopenaeus vannamei的蛻皮激素調(diào)節(jié)蛋白(ABD65303)同源性為34.4％，與Bombyx mori蛻皮激素調(diào)節(jié)蛋白(NP_001134647)的同源性為25.8％。序列比對(duì)結(jié)果顯示有6個(gè)高度保守的半胱氨酸殘基(Cys22，Cys36，Cys41，Cys87，Cys92，Cys133)。SMAR工程序分

20、析表明，推導(dǎo)的氨基酸序列包含一個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域：the Niemann-Pick type C2(屬于ML家族)結(jié)構(gòu)域。是由119個(gè)氨基酸組成開始在Tyr19并在Val138結(jié)束。在ML保守結(jié)構(gòu)域上有22個(gè)公認(rèn)的膽固醇/脂質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)。采用SWISS-MODEL模型預(yù)測中華絨螯蟹蛻皮激素調(diào)節(jié)蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)，根據(jù)與其他物種相同蛋白很高的相似性，建立的三級(jí)結(jié)構(gòu)的模板為：lnepA。模擬結(jié)構(gòu)的氨基酸殘基范圍開始于第16個(gè)殘疾和結(jié)束于第141殘基和

21、序列結(jié)構(gòu)同源性為28.9％。在整個(gè)中華絨螯蟹蛻皮激素調(diào)節(jié)蛋白推導(dǎo)的氨基酸序列結(jié)構(gòu)主要是β-折疊。采用實(shí)時(shí)定量RT-PCR的方法分析中華絨螯蟹蛻皮激素調(diào)節(jié)蛋白在不同組織中以β-actin作為內(nèi)參的相對(duì)表達(dá)情況。組織中的表達(dá)分析顯示，中華絨螯蟹蛻皮激素調(diào)節(jié)蛋白的mRNA主要是在肝胰腺組織中表達(dá)，在腦神經(jīng)節(jié)中表達(dá)相對(duì)較高，在性腺、胃、肌肉和胸神經(jīng)節(jié)中表達(dá)較少，而在心，鰓，血淋巴和腸中不表達(dá)。在肝胰腺中的表達(dá)最豐富，這與肝胰腺的功能密切相關(guān)，肝