發(fā)展及優(yōu)化高通量鈣熒光方法篩選TRPV3通道天然抑制劑及藥理學(xué)活性評(píng)價(jià).pdf

1、分類號(hào)：R966R966密級(jí)：公開公開UDC：610610學(xué)校代碼：1106511065碩士學(xué)位論文發(fā)展及優(yōu)化高通量鈣熒光方法篩選TRPV3通道天然抑制劑及藥理學(xué)活性評(píng)價(jià)孫曉梅指導(dǎo)教師王克威（教授）學(xué)科專業(yè)名稱藥理學(xué)論文答辯日期2017年5月21日I發(fā)展及優(yōu)化高通量鈣熒光方法篩選發(fā)展及優(yōu)化高通量鈣熒光方法篩選TRPV3通道天然抑制劑通道天然抑制劑及藥理學(xué)活性評(píng)及藥理學(xué)活性評(píng)價(jià)摘要瞬時(shí)受體電位（TransientReceptPotenti

2、alTRP）通道家族成員TRPV3是一種鈣通透性、配體門控的非選擇性陽(yáng)離子通道。TRPV3通道作為一種溫覺(jué)感受器，激活溫度范圍為33℃39℃，其主要分布于人體的背根神經(jīng)節(jié)、三叉神經(jīng)節(jié)和皮膚角化細(xì)胞等中樞神經(jīng)和外周感覺(jué)系統(tǒng)。研究發(fā)現(xiàn)，TRPV3通道不僅與溫度感受相關(guān)，還與疼痛、瘙癢以及皮膚毛發(fā)生長(zhǎng)等生理活動(dòng)和病例有著密切的聯(lián)系。雖然TRPV3通道與眾多生理病理活動(dòng)相關(guān)，但目前尚卻缺乏特異性作用于TRPV3通道的工具藥，使得TRPV3通道的

3、藥理學(xué)研究受到極大地限制。研究目的研究目的發(fā)展、優(yōu)化高通量篩選TRPV3通道調(diào)節(jié)劑的方法，尋找TRPV3通道的特異性抑制劑。研究方法研究方法采用FlexStation3儀器，通過(guò)優(yōu)化表達(dá)TRPV3通道的HEK293T細(xì)胞密度、Cal520鈣熒光染料的孵育時(shí)間和濃度、以及TRPV3的非特異性激動(dòng)劑2APB樟腦與釕紅（TRPV3非選擇性抑制劑）的加藥先后順序等四個(gè)條件，對(duì)高通量鈣熒光篩選TRPV3離子通道調(diào)節(jié)劑的方法進(jìn)行條件優(yōu)化；運(yùn)用抑制劑

4、釕紅，評(píng)價(jià)2APB所致鈣熒光信號(hào)的增強(qiáng)是否來(lái)自直接通過(guò)激活TRPV3通道；通過(guò)應(yīng)用優(yōu)化后的高通量篩選方法，篩選靶向TRPV3通道的天然調(diào)節(jié)劑；應(yīng)用全細(xì)胞膜片鉗記錄進(jìn)行活性確認(rèn)及選擇性評(píng)價(jià)；對(duì)天麻干燥的塊莖運(yùn)用減壓加熱回流、HPD100大孔吸附樹脂、ODS柱、硅膠柱、HPLC高效液相色譜儀，結(jié)合正向、反向薄層色譜對(duì)天麻有效成分進(jìn)行提取分離；采用優(yōu)化的高通量篩選方法對(duì)天麻提取物進(jìn)行靶向TRP通道的活性測(cè)定與評(píng)價(jià)。研究結(jié)果研究結(jié)果本研究成功建

5、立并優(yōu)化了高通量鈣熒光篩選TRPV3離子通道調(diào)節(jié)劑的方法，得到的最佳篩選條件為細(xì)胞密度40000個(gè)細(xì)胞孔、Cal520鈣熒光染料濃度為5.0%、孵育時(shí)間為1.5h、篩選TRPV3通道調(diào)節(jié)劑時(shí)應(yīng)先加入抑制劑再加入待測(cè)化合物進(jìn)行測(cè)試；運(yùn)用優(yōu)化的高通量鈣熒光方法，測(cè)得釕紅抑制TRPV3通道的半抑制濃度（IC50）為5.351.39?M，并從天然產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)了新的TRPV3通道抑制劑—甲基蓮心堿。全細(xì)胞膜片鉗記錄實(shí)驗(yàn)測(cè)定甲基蓮心堿抑制TRPV3通