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1、鈣激活氯離子通道(calcium-activated chloride channels,CaCCs)是一類在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中廣泛表達(dá)的陰離子通道,在上皮液體轉(zhuǎn)運(yùn)、腸動(dòng)力調(diào)控、平滑肌收縮、神經(jīng)元興奮和傷害感受等多種生理調(diào)節(jié)過(guò)程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。大量的研究顯示CaCCs功能與慢性便秘、高血壓、先天性巨結(jié)腸、腫瘤及腹瀉等多種疾病密切相關(guān)。長(zhǎng)期以來(lái),雖然功能性研究提示存在多種類型的CaCCs,但是除了2008年得到克隆的TMEM16A(也稱
2、ANOI)外,其它類型的CaCCs的分子身份尚未得到確認(rèn)。發(fā)現(xiàn)新類型的CaCCs不但對(duì)于揭示其確切的生理病理作用具有重要的理論意義,還能為多種疾病的藥物治療提供新的靶標(biāo)。CaCCs特異性的調(diào)節(jié)劑是目前研究其多種病理生理功能的關(guān)鍵工具,選擇性調(diào)節(jié)劑不但能夠在細(xì)胞和離體組織模型上區(qū)別分析已知和未知CaCCs氯離子通道的活性,而且能夠?yàn)镃aCCs氯離子通道的生理功能和病理生理機(jī)制研究提供有效的分子探針。現(xiàn)有的幾種TMEM16A和腸道上皮一種分
3、子身份未知的CaCC(上皮型CaCC,CaCCGI)氯離子通道選擇性調(diào)節(jié)劑均是從組合化學(xué)小分子庫(kù)中篩選得到的,這些調(diào)節(jié)劑在明確CaCCs的生理功能方面發(fā)揮了巨大的作用。發(fā)現(xiàn)高親和力、選擇性強(qiáng)、適合離體組織和體內(nèi)活性研究的CaCCs小分子調(diào)節(jié)劑仍然是相關(guān)領(lǐng)域研究的重點(diǎn)內(nèi)容。本研究的目標(biāo)是從天然化合物中篩選能夠在腸腔側(cè)抑制TMEM16A和CaCCs氯離子通道從而抑制腸道液體分泌與腸動(dòng)力的天然小分子抑制劑。
本研究中,我們利用穩(wěn)定共
4、轉(zhuǎn)染對(duì)鹵族元素敏感的綠色熒光蛋白YFP(YFP-H148Q/I152L)和人 TMEM16A的FRT細(xì)胞系(FRT-TMEM16A-YFP-H148Q/I152L)作為TMEM16A氯離子通道功能測(cè)定模型,從天然小分子中篩選具有TMEM16A氯離子通道抑制活性的化合物。利用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染YFP(YFP-H148Q/I152L)和人CFTR的FRT細(xì)胞系(FRT-CFTR-YFP-H148Q/I152L)和表達(dá)內(nèi)源性CFTR與CaCCGI氯離子
5、通道的人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞對(duì)上述活性化合物的選擇性進(jìn)行分析;利用熒光測(cè)定模型和短路電流測(cè)定方法對(duì)上述抑制劑的基本分子藥理學(xué)特性進(jìn)行分析;進(jìn)一步利用離體小鼠結(jié)腸粘膜短路電流實(shí)驗(yàn)、小鼠腸蠕動(dòng)實(shí)驗(yàn)和新生小鼠輪狀病毒感染模型對(duì)TMEM16A氯離子通道抑制劑的體內(nèi)活性進(jìn)行分析。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
1.篩選得到兩種木脂素類化合物(kobusin和松樹酯醇二甲醚eudesmin),以及一種萘醌類化合物(左旋紫草素shikonin)對(duì)T
6、MEM16A氯離子通道具有抑制作用,IC50值分別約為20μM(kobusin)、50μM(松樹酯醇二甲醚)與6.5μM(左旋紫草素)。
2.在轉(zhuǎn)染的細(xì)胞上進(jìn)行的短路電流分析顯示kobusin、松樹酯醇二甲醚和左旋紫草素頂膜側(cè)給藥能夠劑量依賴地抑制TMEM16A介導(dǎo)的Cl-電流,IC50值分別為100μM(kobusin)、200μM(松樹酯醇二甲醚)和1μM(左旋紫草素);基底膜給藥kobusin、松樹酯醇二甲醚和左旋紫草素
7、對(duì)TMEM16A氯離子通道沒(méi)有抑制作用。
3.Kobusin與松樹酯醇二甲醚對(duì)人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞CaCCGI氯離子通道介導(dǎo)的Cl-電流具有激活作用,且該活性與ATP對(duì)CaCCGI的激活存在協(xié)同作用。左旋紫草素對(duì)HT-29細(xì)胞CaCCGI氯離子通道具有抑制作用,IC50值約為17.5μM;對(duì)ATP激起的瞬時(shí)電流與持續(xù)電流具有阻斷作用,說(shuō)明HT-29細(xì)胞ATP激活的電流是由不用的CaCCs氯離子通道介導(dǎo)的;左旋紫草素不影響HT
8、-29細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度。由于kobusin與松樹酯醇二甲醚對(duì)TMEM16A和CaCCGI的作用是相反的,說(shuō)明上述兩種氯離子通道具有不同的分子屬性。
4.功能測(cè)定研究結(jié)果顯示kobusin與松樹酯醇二甲醚對(duì)CFTR氯離子通道具有激活作用,EC50值分別為30μM與50μM;且該活性具有FSK依賴的特點(diǎn),與IBMX具有相加作用,與Gen具有協(xié)同作用;Kobusin與松樹酯醇二甲醚對(duì)CFTR氯離子通道的激活作用具有快速可逆的特點(diǎn),
9、激活作用在4 min時(shí)達(dá)到最大激活,洗脫后15 min激活作用完全消失。利用HT-29細(xì)胞進(jìn)行的短路電流測(cè)定結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了kobusin與松樹酯醇二甲醚激活CFTR氯離子通道表現(xiàn)出FSK依賴。
5.離體組織短路電流實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示kobusin與松樹酯醇二甲醚能夠在粘膜側(cè)激活小鼠結(jié)腸粘膜上皮CFTR與CaCCGI介導(dǎo)的Cl-電流,且該激活作用能夠被選擇性抑制劑CFTRinh-172(CFTR)和CaCCinh-A01(CaCC)
10、完全抑制;左旋紫草素在粘膜側(cè)能夠顯著抑制卡巴膽堿激起的短路電流,最大抑制率達(dá)到48%,p<0.01,抑制效率優(yōu)于已知的CaCCGI氯離子通道抑制劑CaCCinh-A01(34%,p<0.05);左旋紫草素在粘膜側(cè)或漿膜側(cè)對(duì)小鼠結(jié)腸粘膜上皮CFTR氯離子通道均無(wú)抑制作用,對(duì)小鼠結(jié)腸粘膜漿膜側(cè)的Na+/K+-ATPase也沒(méi)有抑制作用。
6.體內(nèi)活性研究顯示kobusin、松樹脂醇二甲醚和左旋紫草素口服給藥能夠顯著降低小鼠腸蠕動(dòng)(
11、p<0.01);在病毒感染前一天與病毒感染當(dāng)天開始口服給藥兩種給藥方式下,左旋紫草素均能顯著減少輪狀病毒感染的新生小鼠糞便含水量,且不影響病毒的感染過(guò)程,最大有效作用劑量(0.692 mg/kg)小于CaCCinh-A01(13.6 mg/kg)。
結(jié)論:
1.本研究新發(fā)現(xiàn)三種分屬于不同結(jié)構(gòu)家族的TMEM16A氯離子通道抑制劑,木脂素類化合物(kobusin和松樹酯醇二甲醚)能夠激活CFTR與CaCCGI氯離子通道,
12、萘醌類化合左旋物紫草素能夠抑制CaCCGI氯離子通道。
2.Kobusin與松樹酯醇二甲醚對(duì)TMEM16A與CaCCGI氯離子通道的相反作用為證實(shí)TMEM16A與CaCCGI是分子特性不同的兩種CaCCs氯離子通道提供了確切證據(jù)。
3.證實(shí)了輪狀病毒引起的分泌型腹瀉中腸道液體分泌增加主要是通過(guò)激活CaCCGI氯離子通道實(shí)現(xiàn)的,腸腔側(cè)給藥抑制腸道TMEM16A和CaCCGI氯離子通道能夠顯著減少腸道液體分泌。
13、 4.證實(shí)了TMEM16A在腸動(dòng)力調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用,抑制TMEM16A能夠顯著抑制腸道的蠕動(dòng)。
本研究獲得的CaCCs調(diào)節(jié)劑對(duì)于闡明生理和CaCCs氯離子通道相關(guān)的病理(如便秘和腹瀉)條件下TMEM16A、CaCCGI和CFTR這三種氯離子通道在腸道動(dòng)力學(xué)和腸道液體分泌中的作用具有重要的理論意義,為區(qū)別分析已知和未知CaCCs氯離子通道的活性提供了分子探針。本研究還可為以CaCCs為靶標(biāo)的輪狀病毒引起的分泌型腹瀉治療提供新的
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