Aurora-B激酶抑制劑的系統(tǒng)篩選與活性化合物的發(fā)現(xiàn)及其分子藥理學研究.pdf

1、有絲分裂是生物體最基本的生命活動過程，能將復制的基因組精確地分配到子細胞中，在長期的進化過程中生物體形成了一整套完善的監(jiān)測機制以確保遺傳物質(zhì)精確地分配到子細胞中。Aurora激酶(極光激酶)是細胞有絲分裂調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的一類重要的絲氨酸/蘇氨酸激酶，在整個真核生物的進化過程中都極為保守。在有絲分裂分裂過程中，Aurora激酶通過BubRl、Mad2、Cenp-E、histone H3等底物的磷酸化來調(diào)節(jié)中心體、紡錘體、染色體或者細胞骨架的變

2、化，同時Aurora激酶的活性和定位以及其功能的正常執(zhí)行也受到其上游調(diào)控分子和伙伴分子的調(diào)控。最近幾年的研究表明，在人的多種腫瘤細胞中出現(xiàn)Aurora激酶家族成員的過表達，這意味著該家族成員可能與腫瘤的發(fā)生及發(fā)展有著密切的關(guān)系，被認為扮演著原癌基因的角色。 本研究選擇Aurora激酶為靶標，建立了利用模式生物．基因突變酵母構(gòu)建了利用微生物發(fā)酵液篩選Aurora激酶抑制劑初篩模型，并利用初篩模型篩選了6000份微生物發(fā)酵液粗提物和

3、2000個天然與合成化合物，獲得了一組篩選陽性菌株。本研究利用分子生物學方法，從Hela細胞中提取總RNA，再通過RT-PCR及PCR手段，得到Aurora-B編碼基因(AURKB)的cDNA，克隆到pMD-18T載體，構(gòu)建了重組質(zhì)粒。再將此片斷克隆至表達載體pET-20b(+)中，構(gòu)建重組表達載體，并轉(zhuǎn)化宿主菌-E Coli BL21。IPTG誘導表達后通過Ni2+柱親合層析對表達產(chǎn)物進行純化，獲得了高純度的重組Aurora-B激酶。

4、為構(gòu)建酶活反應(yīng)體系的Aurora-B抑制劑篩選模型奠定基礎(chǔ)。本研究還以Aurora-B的晶體結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，采用虛擬篩選方法，對Microbial Natural Products Database進行了篩選。對獲得的22個候選化合物用酵母細胞篩選模型Y300和ipl1-321進行篩選后，得到一個陽性化合物Jadomycin B。體外酶學分析證實JB能抑制Aurora-B激酶的活性；Western Blot分析證實histone H3的磷酸

5、化水平受到JB的抑制；計算機輔助Docking model顯示JB進入Aurom-B的活性中心并占據(jù)ATP所在位置，利用MTT進行了JB及其衍生物抑制——腫瘤細胞的活性研究，構(gòu)效關(guān)系研究表明JB唑酮環(huán)上側(cè)鏈對Jadomycin類的生物活性起決定性作用。 本研究構(gòu)建了初篩與活性評價，實物篩選與結(jié)構(gòu)虛擬篩選相結(jié)合的微生物來源Aurora-B抑制劑的篩選系統(tǒng)。利用這一篩選系統(tǒng)，我們首次發(fā)現(xiàn)了微生物產(chǎn)物Jadomycin B的Auror