刃天青顯色法和Dxr酶抑制劑模型對(duì)海洋真菌來(lái)源抗弧菌活性物質(zhì)的高通量篩選.pdf

1、弧菌病是水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)最重要的細(xì)菌病之一，其爆發(fā)后死亡率高，給我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失。人們?yōu)榱朔乐嗡a(chǎn)動(dòng)物弧菌病，大量盲目使用抗生素，使耐藥性菌株不斷出現(xiàn)，使病害更加難以控制，需要不斷地尋找新的、安全的抗菌藥物。海洋真菌因其獨(dú)特生長(zhǎng)代謝機(jī)制，具有產(chǎn)生大量結(jié)構(gòu)新穎、活性強(qiáng)的化合物的潛力，成為當(dāng)下國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)。
　　本研究以篩選抗弧菌的活性化合物為目標(biāo)，建立刃天青熒光高通量微量顯色法，優(yōu)化刃天青顯色法實(shí)驗(yàn)條件，并對(duì)比平板稀

2、釋法，評(píng)價(jià)了刃天青方法在測(cè)定藥物對(duì)弧菌最低抑菌濃度(MIC)實(shí)驗(yàn)中的適用可行性，并實(shí)現(xiàn)了對(duì)來(lái)源于32株海洋真菌的916個(gè)初級(jí)餾分的活性篩選，具有直觀、可靠、靈敏、微量、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)。根據(jù)篩選結(jié)果和相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道挑出尖刀鐮孢菌、白色側(cè)齒霉、黃曲霉三株真菌進(jìn)行重新發(fā)酵，利用正相反相柱層析、TLC、HPLC方法分離出次級(jí)餾分，用刃天青顯色方法進(jìn)行活性跟蹤，從白色側(cè)齒霉發(fā)酵物中分離出對(duì)供試弧菌均有抑菌活性的新化合物EngyodontiuminA。<

3、br>　　萜類化合物及其衍生物是自然界分布最廣泛、結(jié)構(gòu)最復(fù)雜的一類次生化合物。生物體內(nèi)的萜類化合物主要有兩種生物合成途徑:甲羥戊酸途徑(mevalonatepathway，MVA)和2-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸途徑(2-methyl-D-erythritol-4-phosphatepathwayMEP)。研究表明，MEP途徑廣泛存在于大多數(shù)致病菌、藻類、地衣及高等植物等，但目前尚未在人體和動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)該途徑，因此該途徑的關(guān)鍵酶已成為潛

4、在抗菌素、抗瘧藥物和除草劑的靶點(diǎn)。1-脫氧-D-木酮糖5-磷酸還原異構(gòu)酶(DXR)是該途徑中第一個(gè)限速酶，本實(shí)驗(yàn)克隆和表達(dá)創(chuàng)傷弧菌DXR蛋白并優(yōu)化其酶活測(cè)定方法，在此基礎(chǔ)上建立弧菌DXR抑制劑高通量篩選模型，并對(duì)利用刃天青篩選出的有抗菌活性的20個(gè)次級(jí)餾分進(jìn)行DXR酶活性研究，獲得2個(gè)陽(yáng)性餾分，在進(jìn)一步的深入研究中有望于從這些餾分中找到DXR酶的有效抑制劑，同時(shí)揭示其抗微生物的可能分子機(jī)制。兩種方法為新型抗菌藥物或先導(dǎo)化合物發(fā)現(xiàn)提供了依