中醫(yī)氣虛血虛模型與造血干-祖細胞衰老.pdf

1、目的
　　隨著世界和我國人口老齡化進程的加快、人口壽命的延長，衰老與延緩衰老的研究已成為生命科學和社會科學共同關注的熱點問題。生長、發(fā)育、衰老與死亡是不可避免的生命自然規(guī)律，但防治病理性衰老是可以實現(xiàn)的。最新研究認為，機體干細胞的衰老是生物體衰老的關鍵原因，因此，探討延緩干細胞衰老方法和調控衰老干細胞靶向分化對闡述衰老的現(xiàn)代生物學機理與防治老年性疾病有重要的理論意義和應用價值。造血干細胞(HSC)是最受關注的成體干細胞，它具有自我

2、更新和多向分化潛能，是所有血細胞的始祖細胞，在特點條件下還可形成某些非造血細胞。目前研究證明，HSC衰老與生物體的衰老和多種老年性疾病密切相關。由此可見，研究HSC衰老的生物學特性，尋找延緩其衰老途徑已經成為干細胞領域研究的熱門課題。
　　“氣虛血虛”是中醫(yī)臨床常見的基礎病癥，構建“氣虛血虛”模型是研究其現(xiàn)代生物學機理的基礎。在臨床上氣虛往往表現(xiàn)為免疫功能低下，而免疫細胞的功能缺陷是導致免疫系統(tǒng)功能低下的關鍵因素。免疫細胞起源造血

3、干細胞，推測造血干細胞衰老或功能低下是氣虛癥的本質所在。中醫(yī)臨床的血虛與現(xiàn)代醫(yī)學的貧血相似，認為血細胞生成、釋放和丟失失調所致的貧血是血虛的本質所在。由此可見，中醫(yī)的氣虛血虛與造血干細胞功能都有密切關系，迄今還未見從造血干細胞角度研究氣虛血虛機理的報道。本課題采用X射線全身照射(TBI)和鹽酸苯肼注射建立小鼠骨髓抑制和貧血模型，探討中醫(yī)“氣虛血虛”的現(xiàn)代生物學機理，并重點研究造血干細胞衰老與“氣虛血虛”的生物學關系，為尋找延緩造血干細胞

4、衰老的方法提供理論指導及實驗依據。
　　方法
　　1氣虛血虛模型構建：模型組，小鼠全身一次性X線照射，劑量為6.5GY，6h后腹腔注射40mg/Kg鹽酸苯肼；對照組：僅作假照射，同時間注射等量生理鹽水，兩組小鼠實驗前后均常規(guī)飼養(yǎng)。
　　2氣虛血虛模型小鼠相關指標檢測：模型構建第3、7、14、28天，分別觀察模型組與對照組小鼠的行為表現(xiàn)；采集外周血，檢測外周血象；頸椎脫臼處死小鼠，取殷骨并計算骨髓單個核細胞數、造血干細胞

5、數，取脾測定脾指數、脾臟病理切片觀察形態(tài)學。
　　3 Sca-1+HSC/HPC分離、純化與鑒定：免疫磁珠磁性分選法(MACS)分離、純化Sea-1+HSC/HPC，流式細胞術檢測分選細胞百分率、免疫熒光染色鑒定細胞性質，臺酚藍染色鑒定細胞活性。
　　4細胞衰老生物學檢測：衰老相關p-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色、混合性造血祖細胞集落(CFU-Mix)培養(yǎng)、細胞周期測定評價干細胞的生物學衰老特征。
　　5衰老基因

6、檢測：PCR檢測與衰老相關的基因，包括p16INK4a，p53。
　　結果
　　1模型組小鼠在各時間點上均表現(xiàn)出精神萎靡、行為遲緩，進食減少，駝背倦怠和毛色失潤等，符合中醫(yī)“氣虛血虛”病癥。外周血白細胞、紅細胞、血紅蛋白和血小板數顯著降低，紅細胞和血紅蛋白水平在第7d下降至最低點，第28d各指標仍沒有完全恢復至正常水平。骨髓單個核細胞即刻降低，第3d降到了最低點，第7d逐漸緩慢恢復，14d恢復至對照組水平的50％，第28d恢

7、復到對照組的65.7％；Sca-1+HSC在第3d急劇下降，在第7d恢復緩慢。14d恢復至對照組的14.5％，第28天恢復到21.3％。脾指數均明顯降低，脾臟組織結構出現(xiàn)退行性變化。
　　2 MACS分選前，骨髓單個核細胞(MNCs)中的Sca-1+細胞百分比為1.8±1.2％；MACS分離純化后，Sca-1+細胞百分比可達87.33±1.25％。分選前MNCs中極少細胞表達Sca-1+陽性，分離純化后的標記細胞中有大量的細胞表達

8、Sca-1+；分選的Sca-1+HSC/HPC活性為96％～99％。
　　3模型組小鼠Sca-1+HSC/HPC的β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色百分率顯著增加；混合性造血祖細胞集落(CFU-Mix)形成數減少，集落細胞數少：HSC細胞出現(xiàn)G1期阻滯，其G0/G1期比例明顯增高，S期比例減少，其中第3-7d細胞周期在G1期的阻滯最為嚴重，第28d后逐漸恢復并接近對照組水平。
　　4模型組中小鼠衰老相關基因灰度值p16I