人參皂苷Rg1調(diào)控輻射導(dǎo)致造血干-祖細(xì)胞衰老的機(jī)理.pdf

1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?
　　衰老相關(guān)研究是近年來(lái)生命科學(xué)的一個(gè)熱點(diǎn)，老年性疾病的高發(fā)率及社會(huì)人口老齡化進(jìn)程的不斷加快，使得衰老相關(guān)機(jī)理的研究和延緩衰老的研究不再單單是一個(gè)醫(yī)學(xué)問(wèn)題，更成為一個(gè)社會(huì)問(wèn)題。機(jī)體最基本的構(gòu)成單位和功能單位是細(xì)胞，而干細(xì)胞更是維持成熟且具有功能的組織和器官的穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵。因?yàn)楦杉?xì)胞具有高度的自我更新和增殖分化能力，所以在傳統(tǒng)觀念上它被認(rèn)為是不朽的不會(huì)衰老的。然而當(dāng)受到機(jī)體內(nèi)部因素或者外部損傷因素的作用下，組織修復(fù)能力的降

2、低和癌癥的易感率的增高，表明干細(xì)胞可能發(fā)生著各種內(nèi)外因素造成其損傷相關(guān)的功能下降甚至衰老。
　　造血干細(xì)胞（hematopoietic stem cell，HSC）負(fù)責(zé)終身生產(chǎn)所有類(lèi)型的血細(xì)胞，因此它位于機(jī)體造血系統(tǒng)地頂層，它的衰老不僅關(guān)系著造血系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)，更有實(shí)驗(yàn)證明HSC衰老與機(jī)體的衰老有密切的聯(lián)系。最近的研究報(bào)道，DNA損傷是導(dǎo)致成體干細(xì)胞數(shù)量減少和功能衰退的主要機(jī)制之一。事實(shí)上生物基因組的完整性受到內(nèi)源性和外源性

3、多種損傷因素的影響，其中輻射致細(xì)胞DNA損傷的積累，是導(dǎo)致細(xì)胞衰老和疾病發(fā)生的一個(gè)重要因素。
　　幾千年傳承下來(lái)的祖國(guó)中醫(yī)醫(yī)學(xué)博大精深，如何將祖國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)與現(xiàn)代西醫(yī)合理有效的結(jié)合起來(lái)具有重要的意義同時(shí)也是本課題的創(chuàng)新所在。人參是祖國(guó)醫(yī)學(xué)的名貴藥材，它具有活血、補(bǔ)氣治療勞傷虛損的作用?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證明人參中提取的人參皂苷單體Rg1(ginsenoside Rg1)是其主要藥物活性成分之一。已有研究報(bào)道，人參及其提取物對(duì)細(xì)胞有輻射保護(hù)

4、作用。迄今，尚不清楚人參皂苷調(diào)控輻射所致造血干細(xì)胞衰老的機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)x射線全身照射(TBI)誘導(dǎo)小鼠造血干/祖細(xì)胞DNA損傷，進(jìn)而探討電離輻射損傷導(dǎo)致的造血干細(xì)胞衰老過(guò)程中人參皂苷單體Rg1的抗衰老作用及其相關(guān)的調(diào)控機(jī)制。能夠?yàn)槲覀兿乱徊綄ふ液线m的途徑和時(shí)間點(diǎn)來(lái)對(duì)造血干細(xì)胞衰老進(jìn)行有效的干預(yù)提供重要的理論及實(shí)踐依據(jù)。
　　實(shí)驗(yàn)方法:
　　1.電離輻射誘導(dǎo)造血干細(xì)胞衰老模型構(gòu)建:模型組，C57BL/6小鼠全身一次性）x線照

5、射，劑量為6.5GY;對(duì)照組:作假照射，采取于輻射組相同處理，但不進(jìn)行照射。
　　2.模型小鼠衰老相關(guān)指標(biāo)檢測(cè):照射后第3、7、14、28天，分別觀察各組小鼠的行為表現(xiàn);采集外周血，檢測(cè)外周血象;脫頸處死小鼠后，取出脾臟測(cè)定脾指數(shù)，取兩側(cè)股骨及脛骨，沖出骨髓后計(jì)數(shù)骨髓單個(gè)核細(xì)胞及造血干細(xì)胞。
　　3.造血干/祖細(xì)胞的分離、純化與鑒定:將提取出的骨髓單個(gè)核細(xì)胞通過(guò)MACS分選得到標(biāo)記細(xì)胞;流式檢測(cè)標(biāo)記細(xì)胞中Sca-1+HSC/

6、HPC的百分比。臺(tái)酚藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞存活率。
　　4.Sca-1+HSC/HPC衰老相關(guān)生物學(xué)檢測(cè):SA-β-gal染色檢測(cè)細(xì)胞的衰老。增殖與分化能力通過(guò)混合性集落的(CFU-Mix)培養(yǎng)測(cè)定;流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定其處于G1期阻滯的細(xì)胞比例。
　　5.單細(xì)胞凝膠電泳（彗星試驗(yàn)）檢測(cè)造血干細(xì)胞DNA損傷情況。
　　6.Sca-1+HSC/HPC中超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量的檢測(cè)。
　　7.衰老相關(guān)基

7、因及其蛋白表達(dá)檢測(cè):PCR檢測(cè)與衰老相關(guān)的基因p16INK4a、p19Arf、p53、p21Cip1/WaflmRNA的表達(dá)，Western blot檢測(cè)其蛋白的表達(dá)以研究Rg1延緩或治療Sca-1+HSC/HPC衰老與p16INK4a-Rb和p19Arf-p53-p21Cip1/Wafl信號(hào)通路之間的關(guān)系實(shí)驗(yàn)。
　　結(jié)果:
　　1.照射后的各時(shí)間點(diǎn)，模型組小鼠均表現(xiàn)為精神不振、行為遲緩，進(jìn)食減少和毛色失潤(rùn)等。外周血象下降明

8、顯。亞致死劑量照射后照射組小鼠單個(gè)股骨的骨髓單個(gè)核細(xì)胞數(shù)目及其分選后的Sca-1+HSC/HPC數(shù)目較假照射組均急劇下降。脾指數(shù)明顯降低。
　　2.免疫磁珠分離純化后，流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示Sca-1+細(xì)胞純度為93.66±0.83％。分選的Sca-1+細(xì)胞活性為96％～99％。
　　3.照射組Sca-1+HSC/HPC數(shù)量于照射后1d急劇下降，照射后3d耗竭至最低，照射后7d開(kāi)始緩慢恢復(fù)。照射Rg1組Sca-1+HSC/HPC

9、數(shù)量于照射后1天大幅下降，照射后3d回升，照射后7d回升加快。
　　4.照射組分選后的Sca-1+HSC/HPC其SA-β-gal染色陽(yáng)性率較假照射組顯著增加;照射Rg1組陽(yáng)性率低于照射組。照射組混合性造血祖細(xì)胞集落形成數(shù)減少，集落細(xì)胞數(shù)少，照射Rg1組形成CFU-Mix的數(shù)量明顯較照射組明顯增加。流式細(xì)胞檢測(cè)顯示照射組細(xì)胞G0/G1期比例明顯增高;在照射后第3天和第7天照射Rg1組G1期細(xì)胞比例較照射組降低。
　　5.熒光

10、顯微鏡下觀察顯示，假照射組細(xì)胞核基本完整，呈圓形，細(xì)胞核染色體DNA未出現(xiàn)明顯遷移。而照射組中多數(shù)細(xì)胞DNA有明顯的彗星狀尾部，照射Rg1組的細(xì)胞也可見(jiàn)彗尾，但長(zhǎng)度和面積均小于照射組。照射組的尾長(zhǎng)和Olive尾矩均明顯大于假照射組和照射Rg1組。
　　6.與假照射組相比，照射組Sca-1+HSC/HPC的SOD活性明顯降低，MDA含量明顯升高;與照射組相比，照射Rg1組Sca-1+HSC/HPC SOD活性明顯升高，MDA含量明顯

11、降低。
　　7.全身一次性照射后1d，照射組造血干祖細(xì)胞的衰老相關(guān)基因(p16INK4a、p19Arf、p53、p21Cip1/Wafl)mRNA表達(dá)水平顯著高于假照射組;照射Rg1組基因的mRNA的表達(dá)水平低于照射組8.Western blot結(jié)果顯示照射組造血干祖細(xì)胞的衰老相關(guān)基因p16INK4a，p19Arf，p53，p21Cip1/Wafl蛋白表達(dá)水平較假照射組明顯升高;照射Rg1組蛋白表達(dá)水平低于照射組。
　　結(jié)論