骨髓造血干祖細(xì)胞微環(huán)境的形成.pdf

1、目的：造血干細(xì)胞(Hematopoietic stem cells，HSC)是最早被研究和利用的成體干細(xì)胞之一。由于體內(nèi)HSC的命運(yùn)取決于其與其所在的骨髓HSC微環(huán)境(niche)間復(fù)雜而動(dòng)態(tài)的分子信號(hào)交流，因此，進(jìn)一步解析機(jī)體造血調(diào)控的機(jī)制，以及如何在體外大量擴(kuò)增HSC，同時(shí)維持其自我更新和多向分化的潛能，至今仍是血液學(xué)研究領(lǐng)域中的重要問題。1978年，Ray Schofield首次揭示了骨髓niche對(duì)于 HSC的重要調(diào)控作用。此后

2、，逐步發(fā)展的實(shí)驗(yàn)技術(shù)和實(shí)驗(yàn)手段使人們能夠去研究niche結(jié)構(gòu)生物學(xué)，不同niche組分的特定功能，以及其在血液疾病發(fā)生發(fā)展過程中的作用。目前研究發(fā)現(xiàn)，骨髓niche主要有骨內(nèi)膜niche和血管周niche兩大類，但是對(duì)于構(gòu)成骨髓niche的細(xì)胞組分來源知之甚少。本課題旨在探究構(gòu)成骨髓niche細(xì)胞的來源，以及細(xì)胞自噬在其中的作用。具體目標(biāo):(1)明確骨髓移植前致死劑量輻照對(duì)骨髓niche的破壞作用;(2)探究供體造血干祖細(xì)胞是否參與移植

3、后受體骨髓niche的重建;(3)探究造血干祖細(xì)胞的正常自噬功能對(duì)骨髓niche形成的影響。
　　方法：(1)給予野生型小鼠9 Gy致死劑量60Co伽馬射線全身輻照，采用流式檢測(cè)小鼠骨髓中造血細(xì)胞以及非造血的骨髓微環(huán)境細(xì)胞的比例以及數(shù)量變化情況，并通過CCK-8檢測(cè)輻照對(duì)骨髓單個(gè)核細(xì)胞的生存活力的影響。(2)采用具有自噬基因標(biāo)記的Atg7f/f;GFP-LC3小鼠作為供體，分選骨髓LSK造血干祖細(xì)胞移植至WT小鼠體內(nèi)，同時(shí)設(shè)置反向

4、移植對(duì)照實(shí)驗(yàn)。造血重建后流式檢測(cè)是否存在骨髓niche的重建，并流式檢測(cè)GFP陽性細(xì)胞比例以及基因型鑒定檢測(cè)骨髓niche重建的細(xì)胞來源。(3)采用Micro-CT掃描、流式細(xì)胞術(shù)、骨髓切片HE染色、免疫組化、實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR技術(shù)檢測(cè)造血干祖細(xì)胞功能異常(Atg7f/f;Vav-Cre小鼠)對(duì)骨髓niche結(jié)構(gòu)、細(xì)胞組分、功能的影響。(4)采用競(jìng)爭性移植實(shí)驗(yàn)檢測(cè)造血干祖細(xì)胞功能異常對(duì)骨髓niche形成的影響;并將野生型小鼠骨髓移

5、植到Atg77/7;Vav-Cre小鼠體內(nèi)進(jìn)行挽救實(shí)驗(yàn)，通過流式細(xì)胞術(shù)、集落形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)造血干祖細(xì)胞重建骨髓niche的能力。
　　結(jié)果：(1)9Gy致死劑量輻照不僅能夠清除骨髓中的有核造血細(xì)胞，也能夠?qū)撬鑞iche包括基質(zhì)細(xì)胞、CAR細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞在內(nèi)的骨髓niche細(xì)胞產(chǎn)生顯著的殺傷作用。（2)骨髓移植造血重建的過程中同樣存在非造血的骨髓niche的重建，并且重建的細(xì)胞可以來源于供體的LSK造血干祖細(xì)胞細(xì)胞。（3)造血干祖細(xì)