鐵過載誘導(dǎo)ROS生成對造血干祖細(xì)胞功能的影響.pdf

1、目的：體外分離并培養(yǎng)單個核細(xì)胞(MNC)，建立鐵過載造血細(xì)胞模型，探討鐵過載對造血細(xì)胞內(nèi)活性氧物質(zhì)(ROS)水平的影響以及ROS升高對造血干祖細(xì)胞造血功能的影響及作用機(jī)制。
　　方法：
　　1.體外分離培養(yǎng)骨髓及臍血來源的MNC，通過在培養(yǎng)液中添加枸櫞酸鐵銨(FAC)，誘導(dǎo)造血干祖細(xì)胞鐵過載，從而建立鐵過載造血細(xì)胞模型。并通過檢測細(xì)胞內(nèi)可變鐵池(LIP)水平驗證這一模型的建立。
　　2.分別采用流式細(xì)胞術(shù)檢測鐵過載造血

2、細(xì)胞的ROS水平、凋亡水平、各系造血細(xì)胞計數(shù)，采用甲基纖維素半固體培養(yǎng)法檢測造血集落形成，采用westernblot方法檢測ROS相關(guān)信號因子p38MAPK/p-p38MAPK和AKT表達(dá)的水平。
　　3.分別用去鐵胺(DFO)祛鐵或抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸(NAC)、谷胱甘肽(GSH)清除過多的ROS后，檢測上述指標(biāo)的變化。
　　結(jié)果：
　　1.在體外培養(yǎng)骨髓來源的MNC過程中加入不同濃度(50、200、400μmo

3、l/L)FAC培養(yǎng)不同時間(2、4、8、12、24、36、48h)，發(fā)現(xiàn)骨髓造血細(xì)胞內(nèi)LIP水平升高，且具有時間和濃度依賴性，在含400μmol/LFAC的培養(yǎng)液中培養(yǎng)24h時LIP水平達(dá)到最高。并且在400μmol/LFAC濃度下，培養(yǎng)骨髓造血細(xì)胞24h后骨髓造血細(xì)胞內(nèi)總的ROS、髓系細(xì)胞和紅系細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著升高，分別為對照組的1.77、1.75和2.12倍。分別用DFO和NAC處理后發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)ROS水平明顯降低(p<0.05

4、)。
　　2.在體外培養(yǎng)臍血來源的MNC過程中加入不同濃度FAC(50、100、200、400μmol/L)培養(yǎng)不同時間(6、12、24h)，發(fā)現(xiàn)ROS水平隨著FAC的濃度的增加和培養(yǎng)時間的延長而變化，且在200μmol/LFAC的培養(yǎng)液中培養(yǎng)24h時ROS水平達(dá)到最高。用抗氧化劑NAC和GSH聯(lián)合FAC處理細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，抗氧化劑處理組細(xì)胞內(nèi)總的ROS以及髓系細(xì)胞和紅系細(xì)胞內(nèi)的ROS明顯低于FAC組(p值均小于0.05)。此外，在20

5、0μmol/LFAC的濃度下，培養(yǎng)臍血MNC24h后細(xì)胞內(nèi)總的LIP、髓系細(xì)胞和紅系細(xì)胞內(nèi)LIP水平顯著高于對照組(p<0.05)，但抗氧化劑NAC和GSH對鐵過載細(xì)胞內(nèi)LIP均無明顯影響。
　　3.對ROS相關(guān)信號因子的檢測發(fā)現(xiàn)與對照組相比，F(xiàn)AC組p38MAPK/p-p38MAPK、AKT的表達(dá)明顯增強(qiáng)，用DFO和NAC處理后其表達(dá)均明顯減弱。
　　4.對骨髓來源造血干祖細(xì)胞功能的檢測發(fā)現(xiàn)FAC組細(xì)胞凋亡比例[(24.8

6、0±2.99)％]較對照組[(8.90±0.96)％]顯著升高(p<0.05)；造血集落形成單位(CFU-E、CFU-GM、BFU-E和CFU-mix)計數(shù)明顯低于對照組(p值均小于0.05)；CD34+細(xì)胞比例[(0.39±0.07)％]較對照組[(0.91±0.12)％]也顯著降低(p<0.05)。對臍血造血干祖細(xì)胞造血功能的檢測發(fā)現(xiàn)：FAC組細(xì)胞凋亡比例[(20.90±3.45)％]明顯高于對照組[(9.20±1.29)％](p<

7、0.05)；造血集落形成單位(CFU-E、BFU-E、CFU-GM、CFU-mix)計數(shù)明顯低于對照組(其中CFU-E、BFU-E、CFU-GM差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)；CD34+、CD33+、GlyA+細(xì)胞比例及細(xì)胞計數(shù)均顯著低于對照組(p值均小于0.05)；以上這些損傷均可通過DFO和NAC處理而部分恢復(fù)。
　　結(jié)論：
　　細(xì)胞外鐵可以進(jìn)入造血干祖細(xì)胞內(nèi)，造成細(xì)胞內(nèi)LIP水平升高，誘導(dǎo)細(xì)胞鐵過載。鐵過載通過誘導(dǎo)