七氟醚對老齡大鼠血腦屏障的影響及Wnt-β-catenin-AnnexinA1在其中的作用.pdf

1、目的：探討七氟醚麻醉對老齡大鼠血腦屏障的影響及Wnt/β-catenin-Annexin A1通路在其中的作用。
　　內容：制作老齡大鼠吸入七氟醚模型，從在體水平研究七氟醚對血腦屏障組成部分以及Annexin A1蛋白表達水平的影響。采用7日齡幼鼠腦組織微血管內皮細胞培養(yǎng)技術，從離體水平證明七氟醚對于Wnt/β-catenin通路活性的影響以及后者對Annexin A1表達的調節(jié)。為麻醉藥物的選擇提供參考。
　　方法：該研究

2、主要分為三部分：第一部分采取18至20月齡雄性老齡大鼠，分為對照組（C組）：持續(xù)吸入含有氧濃度為30％的空氣；七氟醚組（S組）：持續(xù)吸入含有不同濃度七氟醚（2.4%，3.1%，3.6%）的混合氣體,吸入持續(xù)時間分別為2h，4h，6h。于術后24h采用過深麻醉方法處死動物，取海馬組織，分別采用伊文氏藍染色以及免疫熒光法對纖維蛋白原fibrinigen進行染色，檢測各組伊文氏藍以及fibrinogen在海馬沉積面積的變化。第二部分為在體實驗

3、。首先采取18至20月齡雄性老齡大鼠，應用免疫熒光染色法，將Annexin A1分別與神經元標記物NeuN、小膠質細胞標記物Iba-1以及血管內皮細胞標記物CD31進行雙染，觀察海馬部位Annexin A1細胞來源。然后制作老齡大鼠吸入七氟醚模型（6h，3.6%），采用western blot方法于麻醉結束后6h、12h、24h檢測老齡大鼠海馬組織內緊密連接蛋白occludin、claudin-3以及claudin-5和ZO-1，黏附連

4、接蛋白VE-cadherin，細胞骨架蛋白F-actin蛋白表達含量的改變，以及麻醉結束后采用western blot和免疫熒光染色法于6h、12h、24h檢測老齡大鼠海馬部位膜聯(lián)蛋白Annexin A1蛋白表達含量的改變。最后將老齡大鼠隨機分為3組：（1）對照組（C組）：持續(xù)吸入含有氧濃度為30%的空氣。（2）七氟醚組（S組）:持續(xù)吸入七氟醚濃度為3.6%的混合氣體6h；（3）人重組Annexin A1+七氟醚組（AS組）:麻醉前1小

5、時尾靜脈注射人重組膜聯(lián)蛋白Annexin A1，后持續(xù)吸入含有七氟醚濃度為3.6%的混合氣體,持續(xù)6h。采用western blot方法檢測麻醉結束后24h時間點老齡大鼠海馬組織內緊密連接蛋白 occludin、claudin-3以及claudin-5和ZO-1，黏附連接蛋白VE-cadherin，細胞骨架蛋白F-actin蛋白表達含量的改變；采用免疫熒光方法檢測麻醉后24h時間點老齡大鼠海馬纖維蛋白原沉積；采用Y迷宮和條件恐懼法檢測麻

6、醉后1d和3d老齡大鼠認知功能。第三部分為離體實驗，分為兩部分。首先采用出生后7d的雄性Wistar大鼠，提取腦組織微血管內皮細胞進行體外培養(yǎng)，重構血腦屏障的體外模型。觀察麻醉前以及采用3.6%七氟醚處理6h后的第6h、12h以及24h內皮細胞總蛋白與核蛋白水平的β-catenin以及總蛋白水平的GSK-3β。然后分別在有/無七氟醚麻醉處理的情況下給予該種培養(yǎng)細胞Wnt/β-catenin的激動劑wnt-3a以及抑制劑DKK1，并采用w

7、estern blot以及免疫熒光方法檢測處理后Annexin A1表達水平。
　　結果：與對照組相比，吸入3.6%濃度七氟醚6h引起麻醉后24h老齡大鼠海馬伊文氏藍以及纖維蛋白原沉積面積均顯著升高。老齡大鼠海馬組織內的Annexin A1與血管內皮標記物CD31高度重合。與麻醉前對照組相比，老齡大鼠海馬血腦屏障occludin，claudin-3，VE-cadherin以及F-actin于麻醉后24h蛋白表達降低；與麻醉前相比，

8、麻醉后24h老齡大鼠海馬Annexin A1表達顯著降低。與S組動物相比， AS組occludin， claudin-3,VE-cadherin以及F-actin于24h后顯著增加，海馬纖維蛋白原沉積陽性面積降低。與C組相比，S組麻醉后1d、3d穿梭次數減少，在新異臂停留時間減少，場景相關僵直百分比下降，條件誘導僵直百分比減少；與S組相比相比，AS組麻醉后1d、3d穿梭次數增多，在新異臂停留時間延長，場景相關僵直百分比升高，條件誘導僵直

9、百分比升高。離體實驗中與未經七氟醚處理組相比，3.6%七氟醚處理6h麻醉結束后第24h微血管內皮細胞內總蛋白與核蛋白水平的β-catenin顯著下降，總蛋白水平的GSK-3β蛋白表達上升。與對照組相比，wnt-3a/DKK1處理顯著提高/降低血管內皮細胞Annexin A1表達。
　　結論：七氟醚麻醉通過抑制Wnt/β-catenin通路活性下調血管內皮細胞內Annexin A1的表達，從而破壞血腦屏障完整性，參與造成老齡大鼠認知