七氟醚對(duì)老齡大鼠血腦屏障的影響及Wnt-β-catenin-AnnexinA1在其中的作用.pdf

1、目的：探討七氟醚麻醉對(duì)老齡大鼠血腦屏障的影響及Wnt/β-catenin-Annexin A1通路在其中的作用。
　　內(nèi)容：制作老齡大鼠吸入七氟醚模型，從在體水平研究七氟醚對(duì)血腦屏障組成部分以及Annexin A1蛋白表達(dá)水平的影響。采用7日齡幼鼠腦組織微血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，從離體水平證明七氟醚對(duì)于Wnt/β-catenin通路活性的影響以及后者對(duì)Annexin A1表達(dá)的調(diào)節(jié)。為麻醉藥物的選擇提供參考。
　　方法：該研究

2、主要分為三部分：第一部分采取18至20月齡雄性老齡大鼠，分為對(duì)照組（C組）：持續(xù)吸入含有氧濃度為30％的空氣；七氟醚組（S組）：持續(xù)吸入含有不同濃度七氟醚（2.4%，3.1%，3.6%）的混合氣體,吸入持續(xù)時(shí)間分別為2h，4h，6h。于術(shù)后24h采用過深麻醉方法處死動(dòng)物，取海馬組織，分別采用伊文氏藍(lán)染色以及免疫熒光法對(duì)纖維蛋白原fibrinigen進(jìn)行染色，檢測(cè)各組伊文氏藍(lán)以及fibrinogen在海馬沉積面積的變化。第二部分為在體實(shí)驗(yàn)

3、。首先采取18至20月齡雄性老齡大鼠，應(yīng)用免疫熒光染色法，將Annexin A1分別與神經(jīng)元標(biāo)記物NeuN、小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物Iba-1以及血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物CD31進(jìn)行雙染，觀察海馬部位Annexin A1細(xì)胞來源。然后制作老齡大鼠吸入七氟醚模型（6h，3.6%），采用western blot方法于麻醉結(jié)束后6h、12h、24h檢測(cè)老齡大鼠海馬組織內(nèi)緊密連接蛋白o(hù)ccludin、claudin-3以及claudin-5和ZO-1，黏附連

4、接蛋白VE-cadherin，細(xì)胞骨架蛋白F-actin蛋白表達(dá)含量的改變，以及麻醉結(jié)束后采用western blot和免疫熒光染色法于6h、12h、24h檢測(cè)老齡大鼠海馬部位膜聯(lián)蛋白Annexin A1蛋白表達(dá)含量的改變。最后將老齡大鼠隨機(jī)分為3組：（1）對(duì)照組（C組）：持續(xù)吸入含有氧濃度為30%的空氣。（2）七氟醚組（S組）:持續(xù)吸入七氟醚濃度為3.6%的混合氣體6h；（3）人重組Annexin A1+七氟醚組（AS組）:麻醉前1小

5、時(shí)尾靜脈注射人重組膜聯(lián)蛋白Annexin A1，后持續(xù)吸入含有七氟醚濃度為3.6%的混合氣體,持續(xù)6h。采用western blot方法檢測(cè)麻醉結(jié)束后24h時(shí)間點(diǎn)老齡大鼠海馬組織內(nèi)緊密連接蛋白 occludin、claudin-3以及claudin-5和ZO-1，黏附連接蛋白VE-cadherin，細(xì)胞骨架蛋白F-actin蛋白表達(dá)含量的改變；采用免疫熒光方法檢測(cè)麻醉后24h時(shí)間點(diǎn)老齡大鼠海馬纖維蛋白原沉積；采用Y迷宮和條件恐懼法檢測(cè)麻

6、醉后1d和3d老齡大鼠認(rèn)知功能。第三部分為離體實(shí)驗(yàn)，分為兩部分。首先采用出生后7d的雄性Wistar大鼠，提取腦組織微血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，重構(gòu)血腦屏障的體外模型。觀察麻醉前以及采用3.6%七氟醚處理6h后的第6h、12h以及24h內(nèi)皮細(xì)胞總蛋白與核蛋白水平的β-catenin以及總蛋白水平的GSK-3β。然后分別在有/無七氟醚麻醉處理的情況下給予該種培養(yǎng)細(xì)胞Wnt/β-catenin的激動(dòng)劑wnt-3a以及抑制劑DKK1，并采用w

7、estern blot以及免疫熒光方法檢測(cè)處理后Annexin A1表達(dá)水平。
　　結(jié)果：與對(duì)照組相比，吸入3.6%濃度七氟醚6h引起麻醉后24h老齡大鼠海馬伊文氏藍(lán)以及纖維蛋白原沉積面積均顯著升高。老齡大鼠海馬組織內(nèi)的Annexin A1與血管內(nèi)皮標(biāo)記物CD31高度重合。與麻醉前對(duì)照組相比，老齡大鼠海馬血腦屏障occludin，claudin-3，VE-cadherin以及F-actin于麻醉后24h蛋白表達(dá)降低；與麻醉前相比，

8、麻醉后24h老齡大鼠海馬Annexin A1表達(dá)顯著降低。與S組動(dòng)物相比， AS組occludin， claudin-3,VE-cadherin以及F-actin于24h后顯著增加，海馬纖維蛋白原沉積陽性面積降低。與C組相比，S組麻醉后1d、3d穿梭次數(shù)減少，在新異臂停留時(shí)間減少，場(chǎng)景相關(guān)僵直百分比下降，條件誘導(dǎo)僵直百分比減少；與S組相比相比，AS組麻醉后1d、3d穿梭次數(shù)增多，在新異臂停留時(shí)間延長(zhǎng)，場(chǎng)景相關(guān)僵直百分比升高，條件誘導(dǎo)僵直

9、百分比升高。離體實(shí)驗(yàn)中與未經(jīng)七氟醚處理組相比，3.6%七氟醚處理6h麻醉結(jié)束后第24h微血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)總蛋白與核蛋白水平的β-catenin顯著下降，總蛋白水平的GSK-3β蛋白表達(dá)上升。與對(duì)照組相比，wnt-3a/DKK1處理顯著提高/降低血管內(nèi)皮細(xì)胞Annexin A1表達(dá)。
　　結(jié)論：七氟醚麻醉通過抑制Wnt/β-catenin通路活性下調(diào)血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)Annexin A1的表達(dá)，從而破壞血腦屏障完整性，參與造成老齡大鼠認(rèn)知