GABA信號(hào)在圍植入期小鼠子宮中的表達(dá)及功能研究.pdf_第1頁(yè)
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1、目的:哺乳動(dòng)物胚胎植入是妊娠成功的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。小鼠胚胎植入及胎盤形成的的主要步驟包括:胚泡滋養(yǎng)外胚層粘附于子宮內(nèi)膜腔上皮;滋養(yǎng)層增殖進(jìn)而穿過(guò)腔上皮;圍繞胚泡粘附周圍的子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞增殖分化為蛻膜細(xì)胞;滋養(yǎng)層分化并具備侵襲表型,穿過(guò)子宮蛻膜組織,進(jìn)入母體血管;最后形成功能性的胎盤。在這一過(guò)程中,子宮內(nèi)膜蛻膜化及滋養(yǎng)層對(duì)蛻膜組織的適度侵襲對(duì)妊娠的建立和維持至關(guān)重要,因此也成為研究熱點(diǎn)。
  最初作為抑制性神經(jīng)遞質(zhì)展開(kāi)研究的γ-氨基

2、丁酸,它的主要功能在于傳遞抑制性的神經(jīng)信號(hào),具有鎮(zhèn)靜、催眠、抗驚厥、降血壓的生理作用,現(xiàn)己被開(kāi)發(fā)合成口服制劑,用于醫(yī)藥衛(wèi)生、農(nóng)業(yè)等,且表現(xiàn)出一定的生產(chǎn)價(jià)值。γ-氨基丁酸可作為胃腸肽,促進(jìn)胃液和生長(zhǎng)激素的分泌,興奮動(dòng)物的采食中樞,從而增加采食量;同時(shí)還可以減少動(dòng)物的無(wú)意識(shí)運(yùn)動(dòng),以減少能量消耗,從而達(dá)到促生長(zhǎng)的目的。近年來(lái),關(guān)于γ-氨基丁酸在外周組織中的調(diào)節(jié)作用備受關(guān)注,尤其是在熱點(diǎn)問(wèn)題之一腫瘤的研究中。γ-氨基丁酸及其受體特異性表達(dá)于外周

3、多種內(nèi)分泌組織和器官腫瘤,并表現(xiàn)出調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力。而在生殖領(lǐng)域的研究中,早期的研究報(bào)道了,γ-氨基丁酸的A型受體π亞基扮演著重要角色。孕激素及其代謝中間物四氫孕酮能通過(guò)π亞基抑制子宮平滑肌的收縮,維持足月妊娠。在大鼠,π亞基在分娩啟動(dòng)前一直保持高水平,而在D19.5日和分娩過(guò)程中含量急劇下降,導(dǎo)致子宮對(duì)四氫孕酮的敏感性減弱,從而解除四氫孕酮對(duì)子宮靜息狀態(tài)的維持,促使分娩的啟動(dòng)。
  在本實(shí)驗(yàn)室的前期研究中發(fā)現(xiàn),

4、在小鼠胚胎植入前期(D1-D4),GABA及其A受體π亞基,B受體B1亞基均動(dòng)態(tài)表達(dá)于子宮腔、腺上皮,并參與了囊胚脫帶及外延生長(zhǎng),提示其參與植入前的母體-胚胎對(duì)話。在本實(shí)驗(yàn)中,我們研究了GABA信號(hào)在小鼠子宮D5-D8中的表達(dá),并探討了GABA信號(hào)對(duì)蛻膜化進(jìn)程的影響及在早期滋養(yǎng)層侵襲中的作用。該研究將為闡明哺乳動(dòng)物胚胎著床的分子機(jī)制補(bǔ)充新的依據(jù),同時(shí)為中樞神經(jīng)遞質(zhì)在生殖領(lǐng)域的研究提供新的視野。
  第一部分:GABA信號(hào)在圍植入期

5、小鼠子宮的表達(dá)
  目的:檢測(cè)GABA、GABRP及GB1在圍植入期小鼠子宮的含量及動(dòng)態(tài)變化。方法:提取總RNA,兩步法RT-PCR檢測(cè)妊娠小鼠D4-D8子宮中GABRP及GB1mRNA水平的表達(dá);制作石蠟切片,采用免疫組化檢測(cè)妊娠小鼠D4-D8子宮中GABA、GABRP及GB1蛋白的表達(dá);提取總蛋白,采用western blot檢測(cè)妊娠小鼠D4-D8子宮中GABRP及GB1蛋白水平的表達(dá);比色法檢測(cè)妊娠小鼠D1-D8子宮中的GA

6、BA含量。結(jié)果:GABRP及GB1 mRNA表達(dá)于D4-D8小鼠子宮。與D4比較,GABRPmRNA的表達(dá)水平在D5及D7植入位點(diǎn)處上升(P<0.05),而在非植入位點(diǎn)之間表達(dá)水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。GABRP mRNA的表達(dá)水平在D6及D8非植入位點(diǎn)處顯著高于對(duì)應(yīng)的植入位點(diǎn)(P<0.05)。在各植入位點(diǎn)中,與D4比較,GB1mRNA的表達(dá)水平僅在D5時(shí)表達(dá)升高(P<0.05)。免疫組化結(jié)果顯示,GABA、GABRP及GB1均

7、表達(dá)于細(xì)胞胞質(zhì)。在D4,GABA、GABRP及GB1表達(dá)于小鼠子宮的腔、腺上皮,而GABA、GABRP還表達(dá)于基質(zhì)細(xì)胞。在D5,GABA、GABRP及GB1表達(dá)于小鼠子宮殘留的腔、腺上皮。在D6-D8,GABA、GABRP及GB1則逐漸出現(xiàn)在初級(jí)蛻膜帶及次級(jí)蛻膜帶的蛻膜細(xì)胞,且GB1還弱表達(dá)于D8的EPCs。Western blot結(jié)果顯示,GABRP及GB1蛋白表達(dá)于D4-D8小鼠子宮。在D4-D8中,GABRP蛋白在D5子宮的植入位

8、點(diǎn)及非植入位點(diǎn)處表達(dá)均達(dá)最高峰,與D4比較,差異均具有極顯著性(P<0.01),但隨后呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。GABRP蛋白在各非植入位點(diǎn)之間的表達(dá)水平與對(duì)應(yīng)植入位點(diǎn)之間無(wú)顯著差異。GB1蛋白在D7子宮的植入位點(diǎn)與非植入位點(diǎn)處表達(dá)均達(dá)最高峰,植入位點(diǎn)與D4比較,非植入位點(diǎn)與D5非植入位點(diǎn)比較,差異均具有顯著性(P<0.05)。比色法結(jié)果顯示,在植入早期(D1-D4),與D1比較,GABA含量D3時(shí)出現(xiàn)上調(diào)(P<0.05),而在D4時(shí)出現(xiàn)下降趨勢(shì)。

9、在植入期(D5-D8),GABA含量在D5植入位點(diǎn)處呈現(xiàn)出最大值,與D4比較,差異具有極顯著性(P<0.01),隨后繼續(xù)出現(xiàn)下降趨勢(shì),且在D6-D8的非植入位點(diǎn)含量顯著高于對(duì)應(yīng)的植入位點(diǎn)處,差異具有極顯著性(P<0.01)。結(jié)論:GABRP及GB1mRNA及蛋白動(dòng)態(tài)表達(dá)于圍植入期的小鼠子宮;GABA含量在圍植入期的小鼠子宮中呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì);GABA及GABRP主要定位于圍植入期D4-D8的小鼠子宮基質(zhì)細(xì)胞及蛻膜區(qū)域的蛻膜細(xì)胞;GB1主

10、要定位于D6-D8的蛻膜區(qū)及D8的絨毛膜錐部位。
  第二部分:GABA信號(hào)在小鼠子宮蛻膜化進(jìn)程的功能研究
  第一節(jié):GABA信號(hào)在小鼠子宮基質(zhì)細(xì)胞體外蛻膜化進(jìn)程的功能研究
  目的:成功建立小鼠子宮基質(zhì)細(xì)胞體外人工誘導(dǎo)蛻膜化模型;檢測(cè)在蛻膜化過(guò)程中,GBARP及GB1 mRNA和蛋白表達(dá)水平的變化;研究GABA及其A受體對(duì)蛻膜化過(guò)程中細(xì)胞增殖、周期及凋亡情況的影響;研究細(xì)胞周期蛋白cyclinD3是否參與GABA及

11、其A受體對(duì)蛻膜化過(guò)程的調(diào)節(jié)。方法:原代提取小鼠子宮基質(zhì)細(xì)胞,用抗基質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物vimentin及上皮細(xì)胞標(biāo)志物cytokeratin抗體,鑒定基質(zhì)細(xì)胞純度并采用間接免疫熒光方法檢測(cè)GABA、GABRP在基質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá);采用E2聯(lián)合P4方法誘導(dǎo)基質(zhì)細(xì)胞發(fā)生蛻膜化,并選取0h,24h,48h及72h4個(gè)時(shí)間點(diǎn),采用western blot檢測(cè)蛻膜化標(biāo)志物PRL的表達(dá),以鑒定蛻膜化體外模型是否建立成功;提取總RNA,兩步法RT-PCR檢測(cè)G

12、ABRP及GB1在0h,24h,48h及72h4個(gè)時(shí)間點(diǎn)的mRNA表達(dá)水平變化;提取總蛋白,western blot檢測(cè)GABRP在0h,24h,48h及72h4個(gè)時(shí)間點(diǎn)的蛋白表達(dá)水平變化;在誘導(dǎo)基質(zhì)細(xì)胞蛻膜化反應(yīng)的同時(shí),分別加入GABA(1μM,10μM及100μM);GABA A受體激動(dòng)劑Muscimol(0.5μM,5μM及50μM);最佳作用濃度的GABA與不同濃度的GABAA受體拮抗劑S106(0.5μM,5μM及50μM)聯(lián)

13、合處理,分別于處理后24h,48h,72h,采用MTS和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)基質(zhì)細(xì)胞增殖,周期分布及凋亡情況,western blot檢測(cè)細(xì)胞cyclinD3的表達(dá)變化情況。結(jié)果:本研究提取的小鼠子宮基質(zhì)細(xì)胞,經(jīng)鑒定,細(xì)胞純度達(dá)95%以上,可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn);Western blot結(jié)果顯示,與0h比較,PRL蛋白表達(dá)水平隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng),表達(dá)水平上調(diào),其差異極有顯著性(P<0.01),提示成功誘導(dǎo)小鼠基質(zhì)細(xì)胞蛻膜化。RT-PCR結(jié)果顯示,與0

14、h比較,GABRP的mRNA表達(dá)水平隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)表達(dá)下調(diào),其差異有顯著性(P<0.05);間接免疫熒光結(jié)果顯示,GABA、GABRP蛋白主要定位于原代提取的基質(zhì)細(xì)胞的胞質(zhì);western blot結(jié)果顯示,與0h比較,GABRP的蛋白表達(dá)水平隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)表達(dá)下調(diào),其差異有顯著性(P<0.05)。MTS結(jié)果顯示,在誘導(dǎo)基質(zhì)細(xì)胞蛻膜化的48h及72h時(shí),1μM GABA和5μM GABAAR激動(dòng)劑Muscimol顯著抑制細(xì)胞增殖

15、(P<0.05),而50μM S106能成功逆轉(zhuǎn)1μM GABA對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用;流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,在48h時(shí),1μM GABA及5μM Muscimol能顯著增加S期的細(xì)胞分布數(shù)量(P<0.05),而50μMS106成功逆轉(zhuǎn)1μM GABA對(duì)細(xì)胞S期的影響;流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,在72h時(shí),1μM GABA及5μM Muscimol能顯著增加細(xì)胞的凋亡數(shù)量(P<0.05);而50μM S106成功逆轉(zhuǎn)1μM GABA對(duì)細(xì)胞凋亡的影

16、響;western blot結(jié)果顯示,與空白對(duì)照比較,在誘導(dǎo)基質(zhì)細(xì)胞蛻膜化的48h及72h時(shí),1μM GABA及5μM Muscimol處理能顯著降低cyclinD3的表達(dá)(P<0.05),而50μM S106成功逆轉(zhuǎn)1μM GABA對(duì)cyclinD3表達(dá)的下調(diào)作用。結(jié)論:體外成功誘導(dǎo)小鼠子宮基質(zhì)細(xì)胞蛻膜化反應(yīng);GABA及GABRP主要定位在基質(zhì)細(xì)胞胞質(zhì),并隨著蛻膜化進(jìn)程,GABRP的mRNA及蛋白表達(dá)水平均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。GABA可能通

17、過(guò)GABAA受體抑制體外基質(zhì)細(xì)胞增殖,促進(jìn)細(xì)胞凋亡,擾亂細(xì)胞周期分布,從而體外抑制蛻膜化過(guò)程,并且cyclinD3參與調(diào)節(jié)該行為。
  第二節(jié):GABA在小鼠子宮體內(nèi)蛻膜化進(jìn)程的功能研究
  目的:探討GABA對(duì)于小鼠子宮體內(nèi)蛻膜化進(jìn)程的影響。方法:于D5開(kāi)始,分別腹腔注射0.05g/kg,0.5g/kg及5g/kg的GABA,每日1次,連續(xù)注射3日;于D8時(shí)處死小鼠,取出子宮,統(tǒng)計(jì)蛻膜鼓包的個(gè)數(shù)及稱重;隨后固定各處理組的蛻

18、膜鼓包,進(jìn)行石蠟切片,隨后行HE染色,采用Image J軟件計(jì)算大核及多核的面積;采用western blot檢測(cè)蛻膜化標(biāo)志物PRL在各組D8子宮植入位點(diǎn)處的表達(dá)。結(jié)果:與空白對(duì)照組比較,0.05g/kg及5g/kgGABA組可顯著減少蛻膜鼓包的數(shù)量(P<0.05),同時(shí),0.5g/kgGABA可減輕蛻膜鼓包重量(P<0.05):通過(guò)ImageJ軟件計(jì)算面積可知,與空白組比較,0.05g/kg及0.5g/kg GABA顯著降低大核多核區(qū)

19、域面積(P<0.05);western blot結(jié)果顯示,與空白對(duì)照組比較,各濃度組的GABA均能顯著降低PRL的表達(dá)量,其差異具有顯著性(P<0.05)。結(jié)論:GABA可能通過(guò)減少蛻膜化的面積及降低蛻膜化反應(yīng)的強(qiáng)度,從而在體內(nèi)抑制小鼠子宮蛻膜化進(jìn)程。
  第三部分:GABA信號(hào)在小鼠早期滋養(yǎng)層侵襲中的功能初探
  目的:研究GABA及其B受體對(duì)蛻膜細(xì)胞侵襲能力及絨毛膜錐(ectoplacental cones,EPCs)外

20、延生長(zhǎng)能力的影響。方法:原代分離D8小鼠子宮蛻膜細(xì)胞,間接免疫熒光檢測(cè)GABA及GB1的表達(dá);采用GABA(1μM,10μM及100μM);Baclofen(0.5μM,5μM及50μM;最佳作用濃度的GABA分別與2-Hydroxysaclofen(0.2μM,2μM及20μM)干預(yù)蛻膜細(xì)胞,transwell小室模型檢測(cè)蛻膜細(xì)胞侵襲能力的變化;原代分離EPCs,種于Matrigel膠上,采用采用GABA(1μM,10μM及100μM

21、);Baclofen(0.5μM,5μM及50μM;最佳作用濃度的GABA分別與2-Hydroxysaclofen(0.2μM,2μM及20μM)干預(yù),分別于24h,48h,72h觀察EPCs粘附及外延生長(zhǎng)情況,采用Image J軟件分析EPCs外延生長(zhǎng)能力的變化。結(jié)果:間接免疫熒光結(jié)果顯示,GABA及GB1表達(dá)于原代蛻膜細(xì)胞胞質(zhì);采用transwell小室模型,計(jì)算下室細(xì)胞數(shù)量,統(tǒng)計(jì)分析可知,100μM GABA,5μM Baclof

22、en減少下室細(xì)胞數(shù)量,提示其抑制蛻膜細(xì)胞的侵襲能力,而20μM2-Hydroxysaclofen可逆轉(zhuǎn)100μM GABA對(duì)細(xì)胞侵襲的抑制作用;顯微鏡下觀察,不同處理組的EPCs均有90%以上的黏附率,其差無(wú)異顯著性,通過(guò)Image J軟件分析可知,在處理后的24h及48h時(shí),100μM GABA及5μM Baclofen均可促進(jìn)EPCs的外延生長(zhǎng)(P<0.05),而20μM2-Hydroxysaclofen可逆轉(zhuǎn)100μM GABA對(duì)

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