GABA信號在圍植入期小鼠子宮中的表達及功能研究.pdf

1、目的：哺乳動物胚胎植入是妊娠成功的關鍵環(huán)節(jié)之一。小鼠胚胎植入及胎盤形成的的主要步驟包括：胚泡滋養(yǎng)外胚層粘附于子宮內(nèi)膜腔上皮；滋養(yǎng)層增殖進而穿過腔上皮；圍繞胚泡粘附周圍的子宮內(nèi)膜基質細胞增殖分化為蛻膜細胞；滋養(yǎng)層分化并具備侵襲表型，穿過子宮蛻膜組織，進入母體血管；最后形成功能性的胎盤。在這一過程中，子宮內(nèi)膜蛻膜化及滋養(yǎng)層對蛻膜組織的適度侵襲對妊娠的建立和維持至關重要，因此也成為研究熱點。
　　最初作為抑制性神經(jīng)遞質展開研究的γ-氨基

2、丁酸，它的主要功能在于傳遞抑制性的神經(jīng)信號，具有鎮(zhèn)靜、催眠、抗驚厥、降血壓的生理作用，現(xiàn)己被開發(fā)合成口服制劑，用于醫(yī)藥衛(wèi)生、農(nóng)業(yè)等，且表現(xiàn)出一定的生產(chǎn)價值。γ-氨基丁酸可作為胃腸肽，促進胃液和生長激素的分泌，興奮動物的采食中樞，從而增加采食量；同時還可以減少動物的無意識運動，以減少能量消耗，從而達到促生長的目的。近年來，關于γ-氨基丁酸在外周組織中的調節(jié)作用備受關注，尤其是在熱點問題之一腫瘤的研究中。γ-氨基丁酸及其受體特異性表達于外周

3、多種內(nèi)分泌組織和器官腫瘤，并表現(xiàn)出調節(jié)腫瘤細胞的增殖、遷移及侵襲能力。而在生殖領域的研究中，早期的研究報道了，γ-氨基丁酸的A型受體π亞基扮演著重要角色。孕激素及其代謝中間物四氫孕酮能通過π亞基抑制子宮平滑肌的收縮，維持足月妊娠。在大鼠，π亞基在分娩啟動前一直保持高水平，而在D19.5日和分娩過程中含量急劇下降，導致子宮對四氫孕酮的敏感性減弱，從而解除四氫孕酮對子宮靜息狀態(tài)的維持，促使分娩的啟動。
　　在本實驗室的前期研究中發(fā)現(xiàn)，

4、在小鼠胚胎植入前期(D1-D4)，GABA及其A受體π亞基，B受體B1亞基均動態(tài)表達于子宮腔、腺上皮，并參與了囊胚脫帶及外延生長，提示其參與植入前的母體-胚胎對話。在本實驗中，我們研究了GABA信號在小鼠子宮D5-D8中的表達，并探討了GABA信號對蛻膜化進程的影響及在早期滋養(yǎng)層侵襲中的作用。該研究將為闡明哺乳動物胚胎著床的分子機制補充新的依據(jù)，同時為中樞神經(jīng)遞質在生殖領域的研究提供新的視野。
　　第一部分：GABA信號在圍植入期

5、小鼠子宮的表達
　　目的：檢測GABA、GABRP及GB1在圍植入期小鼠子宮的含量及動態(tài)變化。方法：提取總RNA，兩步法RT-PCR檢測妊娠小鼠D4-D8子宮中GABRP及GB1mRNA水平的表達；制作石蠟切片，采用免疫組化檢測妊娠小鼠D4-D8子宮中GABA、GABRP及GB1蛋白的表達；提取總蛋白，采用western blot檢測妊娠小鼠D4-D8子宮中GABRP及GB1蛋白水平的表達；比色法檢測妊娠小鼠D1-D8子宮中的GA

6、BA含量。結果：GABRP及GB1 mRNA表達于D4-D8小鼠子宮。與D4比較，GABRPmRNA的表達水平在D5及D7植入位點處上升(P<0.05)，而在非植入位點之間表達水平無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。GABRP mRNA的表達水平在D6及D8非植入位點處顯著高于對應的植入位點(P<0.05)。在各植入位點中，與D4比較，GB1mRNA的表達水平僅在D5時表達升高(P<0.05)。免疫組化結果顯示，GABA、GABRP及GB1均

7、表達于細胞胞質。在D4，GABA、GABRP及GB1表達于小鼠子宮的腔、腺上皮，而GABA、GABRP還表達于基質細胞。在D5，GABA、GABRP及GB1表達于小鼠子宮殘留的腔、腺上皮。在D6-D8，GABA、GABRP及GB1則逐漸出現(xiàn)在初級蛻膜帶及次級蛻膜帶的蛻膜細胞，且GB1還弱表達于D8的EPCs。Western blot結果顯示，GABRP及GB1蛋白表達于D4-D8小鼠子宮。在D4-D8中，GABRP蛋白在D5子宮的植入位

8、點及非植入位點處表達均達最高峰，與D4比較，差異均具有極顯著性(P<0.01)，但隨后呈現(xiàn)下降趨勢。GABRP蛋白在各非植入位點之間的表達水平與對應植入位點之間無顯著差異。GB1蛋白在D7子宮的植入位點與非植入位點處表達均達最高峰，植入位點與D4比較，非植入位點與D5非植入位點比較，差異均具有顯著性(P<0.05)。比色法結果顯示，在植入早期(D1-D4)，與D1比較，GABA含量D3時出現(xiàn)上調(P<0.05)，而在D4時出現(xiàn)下降趨勢。

9、在植入期(D5-D8)，GABA含量在D5植入位點處呈現(xiàn)出最大值，與D4比較，差異具有極顯著性(P<0.01)，隨后繼續(xù)出現(xiàn)下降趨勢，且在D6-D8的非植入位點含量顯著高于對應的植入位點處，差異具有極顯著性(P<0.01)。結論：GABRP及GB1mRNA及蛋白動態(tài)表達于圍植入期的小鼠子宮；GABA含量在圍植入期的小鼠子宮中呈現(xiàn)動態(tài)變化趨勢；GABA及GABRP主要定位于圍植入期D4-D8的小鼠子宮基質細胞及蛻膜區(qū)域的蛻膜細胞；GB1主

10、要定位于D6-D8的蛻膜區(qū)及D8的絨毛膜錐部位。
　　第二部分：GABA信號在小鼠子宮蛻膜化進程的功能研究
　　第一節(jié)：GABA信號在小鼠子宮基質細胞體外蛻膜化進程的功能研究
　　目的：成功建立小鼠子宮基質細胞體外人工誘導蛻膜化模型；檢測在蛻膜化過程中，GBARP及GB1 mRNA和蛋白表達水平的變化；研究GABA及其A受體對蛻膜化過程中細胞增殖、周期及凋亡情況的影響；研究細胞周期蛋白cyclinD3是否參與GABA及

11、其A受體對蛻膜化過程的調節(jié)。方法：原代提取小鼠子宮基質細胞，用抗基質細胞標志物vimentin及上皮細胞標志物cytokeratin抗體，鑒定基質細胞純度并采用間接免疫熒光方法檢測GABA、GABRP在基質細胞中的表達；采用E2聯(lián)合P4方法誘導基質細胞發(fā)生蛻膜化，并選取0h，24h，48h及72h4個時間點，采用western blot檢測蛻膜化標志物PRL的表達，以鑒定蛻膜化體外模型是否建立成功；提取總RNA，兩步法RT-PCR檢測G

12、ABRP及GB1在0h，24h，48h及72h4個時間點的mRNA表達水平變化；提取總蛋白，western blot檢測GABRP在0h，24h，48h及72h4個時間點的蛋白表達水平變化；在誘導基質細胞蛻膜化反應的同時，分別加入GABA(1μM，10μM及100μM)；GABA A受體激動劑Muscimol(0.5μM，5μM及50μM)；最佳作用濃度的GABA與不同濃度的GABAA受體拮抗劑S106(0.5μM，5μM及50μM)聯(lián)

13、合處理，分別于處理后24h，48h，72h，采用MTS和流式細胞術檢測基質細胞增殖，周期分布及凋亡情況，western blot檢測細胞cyclinD3的表達變化情況。結果：本研究提取的小鼠子宮基質細胞，經(jīng)鑒定，細胞純度達95％以上，可用于后續(xù)實驗；Western blot結果顯示，與0h比較，PRL蛋白表達水平隨著誘導時間的延長，表達水平上調，其差異極有顯著性(P<0.01)，提示成功誘導小鼠基質細胞蛻膜化。RT-PCR結果顯示，與0

14、h比較，GABRP的mRNA表達水平隨著誘導時間的延長表達下調，其差異有顯著性(P<0.05)；間接免疫熒光結果顯示，GABA、GABRP蛋白主要定位于原代提取的基質細胞的胞質；western blot結果顯示，與0h比較，GABRP的蛋白表達水平隨著誘導時間的延長表達下調，其差異有顯著性(P<0.05)。MTS結果顯示，在誘導基質細胞蛻膜化的48h及72h時，1μM GABA和5μM GABAAR激動劑Muscimol顯著抑制細胞增殖

15、(P<0.05)，而50μM S106能成功逆轉1μM GABA對細胞增殖的抑制作用；流式細胞術結果顯示，在48h時，1μM GABA及5μM Muscimol能顯著增加S期的細胞分布數(shù)量(P<0.05)，而50μMS106成功逆轉1μM GABA對細胞S期的影響；流式細胞術結果顯示，在72h時，1μM GABA及5μM Muscimol能顯著增加細胞的凋亡數(shù)量(P<0.05)；而50μM S106成功逆轉1μM GABA對細胞凋亡的影

16、響；western blot結果顯示，與空白對照比較，在誘導基質細胞蛻膜化的48h及72h時，1μM GABA及5μM Muscimol處理能顯著降低cyclinD3的表達(P<0.05)，而50μM S106成功逆轉1μM GABA對cyclinD3表達的下調作用。結論：體外成功誘導小鼠子宮基質細胞蛻膜化反應；GABA及GABRP主要定位在基質細胞胞質，并隨著蛻膜化進程，GABRP的mRNA及蛋白表達水平均呈現(xiàn)下降趨勢。GABA可能通

17、過GABAA受體抑制體外基質細胞增殖，促進細胞凋亡，擾亂細胞周期分布，從而體外抑制蛻膜化過程，并且cyclinD3參與調節(jié)該行為。
　　第二節(jié)：GABA在小鼠子宮體內(nèi)蛻膜化進程的功能研究
　　目的：探討GABA對于小鼠子宮體內(nèi)蛻膜化進程的影響。方法：于D5開始，分別腹腔注射0.05g/kg，0.5g/kg及5g/kg的GABA，每日1次，連續(xù)注射3日；于D8時處死小鼠，取出子宮，統(tǒng)計蛻膜鼓包的個數(shù)及稱重；隨后固定各處理組的蛻

18、膜鼓包，進行石蠟切片，隨后行HE染色，采用Image J軟件計算大核及多核的面積；采用western blot檢測蛻膜化標志物PRL在各組D8子宮植入位點處的表達。結果：與空白對照組比較，0.05g/kg及5g/kgGABA組可顯著減少蛻膜鼓包的數(shù)量(P<0.05)，同時，0.5g/kgGABA可減輕蛻膜鼓包重量(P<0.05)：通過ImageJ軟件計算面積可知，與空白組比較，0.05g/kg及0.5g/kg GABA顯著降低大核多核區(qū)

19、域面積(P<0.05)；western blot結果顯示，與空白對照組比較，各濃度組的GABA均能顯著降低PRL的表達量，其差異具有顯著性(P<0.05)。結論：GABA可能通過減少蛻膜化的面積及降低蛻膜化反應的強度，從而在體內(nèi)抑制小鼠子宮蛻膜化進程。
　　第三部分：GABA信號在小鼠早期滋養(yǎng)層侵襲中的功能初探
　　目的：研究GABA及其B受體對蛻膜細胞侵襲能力及絨毛膜錐(ectoplacental cones，EPCs)外

20、延生長能力的影響。方法：原代分離D8小鼠子宮蛻膜細胞，間接免疫熒光檢測GABA及GB1的表達；采用GABA(1μM，10μM及100μM)；Baclofen(0.5μM，5μM及50μM；最佳作用濃度的GABA分別與2-Hydroxysaclofen(0.2μM，2μM及20μM)干預蛻膜細胞，transwell小室模型檢測蛻膜細胞侵襲能力的變化；原代分離EPCs，種于Matrigel膠上，采用采用GABA(1μM，10μM及100μM

21、)；Baclofen(0.5μM，5μM及50μM；最佳作用濃度的GABA分別與2-Hydroxysaclofen(0.2μM，2μM及20μM)干預，分別于24h，48h，72h觀察EPCs粘附及外延生長情況，采用Image J軟件分析EPCs外延生長能力的變化。結果：間接免疫熒光結果顯示，GABA及GB1表達于原代蛻膜細胞胞質；采用transwell小室模型，計算下室細胞數(shù)量，統(tǒng)計分析可知，100μM GABA，5μM Baclof

22、en減少下室細胞數(shù)量，提示其抑制蛻膜細胞的侵襲能力，而20μM2-Hydroxysaclofen可逆轉100μM GABA對細胞侵襲的抑制作用；顯微鏡下觀察，不同處理組的EPCs均有90％以上的黏附率，其差無異顯著性，通過Image J軟件分析可知，在處理后的24h及48h時，100μM GABA及5μM Baclofen均可促進EPCs的外延生長(P<0.05)，而20μM2-Hydroxysaclofen可逆轉100μM GABA對