OPN和integrinβ3在圍植入期小鼠子宮內膜中的表達及其抗體對著床的影響.pdf

1、研究背景和目的： 胚泡著床是指胚泡粘附并植入子宮內膜的一個連續(xù)復雜的生理過程，是胚泡與母體子宮內膜相互作用的過程。胚泡著床過程受到多種因素的調節(jié)，不僅受母體因素和胚泡本身因素的調控，而且還有許多生物大分子物質參與，如骨橋蛋白( osteopontin，OPN)和整合素αvp3等。骨橋蛋白是一種含精氨酸-甘氨酸一天冬氨酸(Arg- Gly- Asp，RGD)的分泌型糖基化磷蛋白，歸類于細胞外基質蛋白。OPN最先是從骨組織分離的，后

2、來發(fā)現(xiàn)在分泌期子宮內膜、入侵內膜的細胞滋養(yǎng)層、內膜腺上皮、蛻膜化的基質細胞及胎盤表面上也有表達。OPN既是細胞因子，又是細胞粘附分子。雖然OPN能與各種整合素受體結合，但是整合素αvβ3是OPN的最主要的受體。OPN的主要生物學功能是通過其特異性序列RGD與整合素等多種受體結合，對細胞的粘附和遷移起重要作用。OPN和整合素αvβ3在胚泡著床中起重要作用。研究OPN和整合素αvβ3對胚泡著床的影響，闡明其作用的分子機制是非常重要的。本研究

3、將從以下幾方面進行研究：(1)建立成功的小鼠早期妊娠模型；(2)檢測骨橋蛋白和整合素p3在圍植入期小鼠子宮內膜中的表達，明確OPN和整合素β3表達規(guī)律；(3)研究骨橋蛋白抗體和整合素β3抗體對小鼠胚泡著床的影響。 方法： 1.小鼠早期妊娠模型的建立 選擇動情前期的雌性昆明小鼠20只，隨機分為二組，每組10只，促排卵組腹腔注射孕馬血清促性腺激素(pregnant mare serumgonadotropin，PMS

4、G)和HCG促排卵治療，對照組注射生理鹽水，隨后雌雄交配，次日檢查陰栓，發(fā)現(xiàn)陰栓計為妊娠第1天(孕Dl)。于妊娠第8天，用頸椎脫臼法處死，迅速剖腹，檢查子宮，記錄所有孕鼠數(shù)及每只孕鼠的著床胚泡數(shù)，計算妊娠率和平均胚泡著床數(shù)；采用化學發(fā)光法檢測促排卵組和對照組的血清及子宮組織雌二醇、孕酮的含量，利用光鏡觀察子宮內膜及卵巢的形態(tài)結構。 2.圍植入期小鼠子宮內膜中OPN和整合素p3蛋白和基因檢測 將清潔級性成熟期昆明小鼠44只

5、，雌性24只，雄性20只，雌性小鼠陰道涂片檢查為動情前期，在此期注射PMSG和HCG，4只雌鼠不合籠，用頸椎脫臼法處死，剪取子宮組織(孕DO，對照組)，直接液氮保存和福爾馬林固定保存，其余的雌：雄小鼠1：1合籠，次日檢查陰栓，發(fā)現(xiàn)陰栓計為妊娠第1天。分別于妊娠第4天，5天，6天，7天，8天用頸椎脫臼法處死，迅速剖腹，剪取子宮組織予以保存(實驗組)，采用免疫組化方法和Western-blotting技術分析圍植入期小鼠子宮內膜中的骨橋蛋白

6、和整合素p3表達規(guī)律，采用RT-PCR技術半定量分析圍植入期小鼠子宮內膜骨橋蛋白和整合素p3 mRNA表達特征。 3.OPN抗體和整合素β3抗體對小鼠胚泡著床的影響 取孕4天小鼠，分別在兩側子宮角內注射骨橋蛋白抗體、整合素β3抗體及生理鹽水，正常妊娠空白對照組未行任何處理，于孕8天處死小鼠，統(tǒng)計胚泡著床數(shù)及妊娠率，取子宮觀察內膜的組織學變化。 結果： 1.用PMSG+HCG建立小鼠早期妊娠模型

7、PMSG+HCG組妊娠率為90％，平均胚泡著床數(shù)9.5±3.6；對照組妊娠率為60％，平均胚泡著床數(shù)3.8±3.9，促排卵組妊娠率和平均胚泡著床數(shù)明顯高于對照組(P<0.05)；促排卵組小鼠血清和子宮組織中的雌二醇和孕酮含量高于對照組，P<0.05;兩組小鼠子宮內膜的形態(tài)變化沒有差異。 2.圍植入期小鼠子宮內膜中的OPN和整合素β3的表達 小鼠整個圍植入期子宮內膜中均有OPN和整合素p3表達，但表達的高峰在著床窗口期，即

8、孕D5。孕DO(非孕)子宮內膜的OPN和整合素p3表達較弱，孕D4時表達增強，孕D5時表達最強，孕D6時表達突然回落，孕D7、孕D8時表達減弱，降至非孕水平。 3.骨橋蛋白抗體和整合素p3抗體抑制胚胎著床 結果顯示骨橋蛋白抗體組小鼠妊娠率為60％，平均胚胎著床數(shù)為1.6±1.19，整合素p3抗體組妊娠率為70％，平均胚胎著床數(shù)為1.7±1.28，明顯低于生理鹽水組及空白對照組(90％，10.0±1.63及100％，10.

9、5±1.58)，提示骨橋蛋白抗體和整合素p3抗體明顯抑制小鼠胚泡著床。 結論： 1.注射PMSG和HCG可有效介導小鼠早期妊娠模型的建立，妊娠率和胚泡著床數(shù)明顯高于自然條件受孕，該模型的建立為進一步研究胚泡著床及子宮內膜容受性等提供理想的技術平臺。 2.骨橋蛋白和整合素p3在圍植入期小鼠子宮內膜中的表達隨著孕齡的增加逐漸增強，但表達的高峰在孕D5，與植入窗的開放相吻合，是子宮內膜接受性的客觀標志，提示骨橋蛋白和整