可溶性鳥苷酸環(huán)化酶激活劑cinaciguat對(duì)高糖狀態(tài)下人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的影響.pdf

1、糖尿病血管病變因其較高的發(fā)生率、致殘率以及致死率成為糖尿病最主要的并發(fā)癥之一。內(nèi)皮功能損傷是糖尿病血管病變的始動(dòng)環(huán)節(jié)和關(guān)鍵。高糖可通過(guò)多種機(jī)制損傷內(nèi)皮功能，如氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等。一氧化氮(NO)作為一種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，能夠通過(guò)NO/可溶性鳥苷酸環(huán)化酶(sGC)/環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)信號(hào)途徑發(fā)揮血管舒張、抗炎、抗氧化的作用。病理情況下，NO與sGC均被氧化，使此信號(hào)通路無(wú)法正常進(jìn)行。Cinaciguat（以下簡(jiǎn)稱CIN）是一種新發(fā)現(xiàn)的s

2、GC激活劑，其既不依賴NO又可激活被氧化的sGC，從而激活上述通路發(fā)揮抗炎、抗氧化的特性。有研究表明其對(duì)心肌梗死、心肌缺血或再灌注損傷、氧化應(yīng)激引起的內(nèi)皮功能紊亂、新生血管內(nèi)膜形成、以及心肌肥大等均有改善作用。但CIN在糖尿病血管病變的發(fā)病過(guò)程中的作用尚不明確。因此本研究選擇高糖誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)損傷模型，模擬糖尿病的體內(nèi)環(huán)境，探索CIN對(duì)糖尿病血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用。
　　目的:
　　觀察CIN對(duì)高糖環(huán)

3、境下人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞一氧化氮(NO)、氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)以及炎癥相關(guān)指標(biāo)的影響，評(píng)價(jià)其對(duì)糖尿病血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用，并初步探討其作用機(jī)制，為糖尿病血管病變的靶向治療提供理論依據(jù)。
　　方法:
　　1.細(xì)胞來(lái)源及培養(yǎng):購(gòu)買的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株置于含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，放入37℃、5％的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
　　2.高糖損傷模型的建立:根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用葡萄糖濃度為33.3mmol/L作用于體外培養(yǎng)的HUV

4、ECs細(xì)胞48h建立高糖損傷模型。
　　3.CIN對(duì)細(xì)胞增殖活性的影響:HUVECs細(xì)胞生長(zhǎng)至70％-80％融合時(shí)，高糖(33.3mmol/L)孵育48h誘導(dǎo)損傷，用CIN（0.01、0.1、1和10μmol/L）處理細(xì)胞48h，MTT法測(cè)細(xì)胞存活率。
　　4.實(shí)驗(yàn)分組:HUVECs細(xì)胞生長(zhǎng)至70％-80％融合時(shí)，將HUVECs隨機(jī)分為4組:①正常組(葡萄糖濃度為5.5mmol/L);②正常組+CIN組（葡萄糖濃度為5.5m

5、mol/L+CIN濃度為1μmol/L）;③高糖組（葡萄糖濃度33.3mmol/L）;④高糖組+ CIN組（葡萄糖濃度為33.3mmol/L+CIN濃度為1μmol/L）。處理48h用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　5.采用硝酸還原酶法測(cè)NO水平。
　　6.氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè):利用熒光探針DCFH-DA檢測(cè)ROS，采用硫代巴比妥酯法、黃嘌呤氧化酶法檢測(cè)MDA、SOD的含量。
　　7.采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)法(RT-PCR)

6、檢測(cè)ICAM-1、VCAM-1的mRNA表達(dá)水平。
　　8.采用免疫印跡法檢測(cè)ICAM-1、VCAM-1、NF-κ Bp65的蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果:
　　1.細(xì)胞存活率的檢測(cè):與正常組相比，高糖組細(xì)胞存活率降為(40.7±10.1)％，與正常組相比下降了59.3％(P＜0.01)。與高糖組相比，高糖+CIN（0.01、0.1、1、10μmol/L）各組的細(xì)胞活性增加為(60.0±13.6)％，(79.1±11.6)

7、％，(93.1±9.1)％、(93.4±9.3)％，與正常組相比增加了40％、20.9％、6.9％、6.6％（均P＜0.05）。但CIN1μmol/L與CIN10μmol/L相比細(xì)胞活性無(wú)明顯差別（P＞0.05）。
　　2.NO的生成量:與正常組相比，高糖組NO生成量明顯減少(18.26±2.03μmol/L vs12.78±0.92μmol/L，P=0.000)。與高糖組相比，高糖組+CIN組NO生成量明顯增加(12.78±0.

8、92μmol/L vs17.24±1.69μmol/L，P=0.001)。與正常組相比，正常組+CIN組NO生成量無(wú)顯著差異（P＞0.05）。
　　3.氧化應(yīng)激:與正常組相比，高糖組ROS生成量顯著增加（1.00±0.00vs2.57±0.44,P=0.002），MDA含量也顯著增加(1.32±0.37nmol/mlvs9.32±2.21nmol/ml，P=0.001)，SOD活性顯著減低(22.82±4.17U/mlvs10.7

9、9±2.66U/ml，P=0.000)。與高糖組相比，高糖組+CIN組ROS生成量顯著降低(2.57±0.44vs1.61±0.28,P=0.01)，MDA的生成量也顯著降低(9.32±2.21nmol/mlvs4.22±1.55nmol/ml，P=0.007)，SOD的活性顯著升高(10.79±2.66U/mlvs18.09±3.36U/ml，P=0.001)。與正常組相比，正常組+CIN組ROS、MDA生成量以及SOD活性無(wú)顯著性差

10、異(P＞0.05)。
　　4.炎癥相關(guān)指標(biāo):與正常組相比，高糖組ICAM-1、VCAM-1 mRNA以及蛋白表達(dá)均顯著增高（P＜0.05），NF-κBp65蛋白表達(dá)也顯著增高(P＜0.05);與高糖組相比，高糖組+CIN組ICAM-1、VCAM-1 mRNA以及蛋白表達(dá)均顯著降低(P＜0.05)、NF-κBp65蛋白表達(dá)也顯著降低（P＜0.05）。與正常組相比，正常組+CIN組ICAM-1、VCAM-1以及NF-κBp65表達(dá)無(wú)顯

11、著性差異（P＞0.05）。
　　結(jié)論:
　　1.高糖可使體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞存活減少，而cinaciguat可逆轉(zhuǎn)被高糖抑制的內(nèi)皮細(xì)胞的活性，保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞。
　　2.高糖使內(nèi)皮細(xì)胞存活減少的機(jī)制包括NO的生成減少、氧化應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)以及炎癥因子增多。
　　3.cinaciguat可通過(guò)提高NO含量，減少氧化應(yīng)激相關(guān)產(chǎn)物ROS和MDA的生成，提高抗氧化酶SOD的活性以及抑制炎癥相關(guān)指標(biāo)ICAM-1、VCAM