槲皮素對高糖環(huán)境下人臍靜脈內皮細胞活性以及MMP-2與MMP-9表達的影響.pdf

1、目的:糖尿病(diabetes mellitus，DM)是一種臨床最常見的慢性疾病之一。隨著經濟發(fā)展及人們生活水平提高，糖尿病的發(fā)病率也逐年升高。糖尿病引起的心、腦、腎及眼底血管等并發(fā)癥更是嚴重影響人們的生活質量，其致殘率及死亡率僅次于腫瘤及心血管疾病。2型糖尿病主要侵犯全身大血管，如主動脈、頸動脈以及下肢動脈，其主要的病理改變?yōu)閯用}粥樣硬化(atherosclerosis，AS)，包括內皮細胞的損傷、血管基質的分解并有動脈中膜的逐漸退

2、變，繼發(fā)性病變可有斑塊內的出血和纖維帽的破裂，以及局部血栓的形成（稱為粥樣硬化-血栓形成，atherosclerosis-thrombosis）。在正常情況下，內皮細胞完好，血管基質合成與分解處于動態(tài)平衡，從而維持正常的血管功能及通透性。但在病理狀態(tài)下，內皮細胞受損，血管基質代謝平衡被打破，導致內膜被破壞，從而使血管中的有形成分滲入到血管中膜，經過一系列復雜的病理變化最終形成粥樣斑塊。高血糖導致AS的機制有很多，其中主要包括:糖基化終產

3、物(AGEs)形成、促進胰島素抵抗(IR)及多元醇代謝異常。它們最終直接或者間接地刺激多種細胞因子及成分如NO、TNF-α、VEGF、ET-1產生，進而引起上述的病理變化。
　　金屬基質蛋白酶(MMPs)是參與基質代謝的最主要酶類之一，MMPs是一個大的家族酶系，其中包括的金屬基質蛋白酶-2（matrixmetalloproteinase，MMP-2）、金屬基質蛋白酶-9(matrix metalloproteinase，MMP-

4、9)，它們均屬于明膠酶，又稱Ⅳ型膠原酶，主要分解Ⅳ型膠原、Ⅴ型膠原及明膠成分，而血管基質的主要成分即為Ⅳ型膠原，故明膠酶在血管基質的降解中起著舉足輕重的作用。
　　尋找抗動脈粥樣硬化的藥物，對糖尿病患者生活質量的提高有重大意義。糖尿病的并發(fā)癥治療效果欠佳，目前開發(fā)研制的西藥對于糖尿病并發(fā)癥的自然進程有一定的延緩作用，但在治療上有一定的局限性，并且存在很多不良反應，而中藥有多層次、多靶點綜合調節(jié)及治療作用。故研發(fā)中藥治療糖尿病的并發(fā)

5、癥引起了越來越多學者的關注。據研究顯示，黃酮類化合物具有抗動脈粥樣硬化、降糖、降壓、抗氧化應激、抑制醛糖還原酶、抑制非酶糖基化等藥理作用。槲皮素(quercetin，Qu)屬于黃酮類中抗氧化還原反應最強的物質之一。有資料顯示，Qu可以有效地發(fā)揮抗動脈粥樣硬化的作用，但機理尚未十分明確。本實驗應用不同濃度的Qu分別作用于高糖環(huán)境下的臍靜脈內皮細胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells，HUVECs)

6、，觀察HUVECs的形態(tài)及數量，并檢測MMP-2及MMP-9的表達水平變化，從而研究槲皮素對高糖環(huán)境下臍靜脈內皮細胞發(fā)揮保護作用的機制，為探索治療糖尿病并發(fā)癥的新途徑奠定基礎。
　　方法:體外培養(yǎng)HUVECs細胞，隨機分組如下:正常對照組(葡萄糖濃度:5.5 mmol/L);高糖組（葡萄糖濃度:30 mmol/L）;高滲組(5.5mmol/L葡萄糖+24.5 mmol/L甘露醇);NG+ Qu（12.5μmol/L、25μmol/

7、L、50μmol/L、100μmol/L）組;高糖+Qu(12.5μmol/L、25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L)組。取對數生長期細胞用于實驗，各組細胞在上述不同條件培養(yǎng)液中培養(yǎng)12、24、48小時，觀察各個時間段的HUVECs細胞數量及形態(tài)，用MTT法檢測不同濃度的Qu對細胞活性的影響。篩選適當濃度的Qu分別在高糖環(huán)境下作用于HUVECs48小時，應用Western blot方法檢測細胞內MMP-2、MMP-9的

8、表達量的變化，酶聯免疫法(ELISA)檢測上清液中MMP-2及MMP-9表達量的變化。
　　結果:
　　1.用MTT法檢測HUVECs的活性，結果顯示:各組組間進行比較，在高糖誘導下，HUVECs活性明顯受抑制，且抑制作用隨時間增加而增強(P＜0.05)。高滲組較正常組無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)，由此基本上可以除外高糖的高滲狀態(tài)影響細胞的活性。NG+Qu(12.5μmol/L、25μmol/L、50μmol/L、100μm

9、ol/L)組的細胞活性較正常組無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)，基本上可以除外藥物本身對細胞的毒性作用。HG+Qu（12.5μmol/L）組在24小時內細胞活性與高糖組無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)，但隨著時間延長其細胞活性較高糖組增高，有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。HG+Qu(25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L)組細胞活性較高糖組均增高，但仍低于正常組，且隨著時間延長及濃度增加，細胞活性逐漸增強（P＜0.05）。高糖組組

10、內進行比較，Qu(12.5μmol/L、25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L)兩兩之間存在統(tǒng)計學差異，且隨濃度升高細胞活性逐漸增強(P＜0.05)。
　　2.用Western blot方法檢測細胞內MMP-2及MMP-9的表達，結果顯示:高糖培養(yǎng)下MMP-2及MMP-9的表達較正常組均增高(P＜0.05)，Qu(25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L)組MMP-2及MMP-9表達較高糖組均減少(P

11、＜0.05)，但仍高于正常組，且呈劑量依賴性。
　　3.用ELISA方法檢測上清液中MMP-2及MMP-9的表達，結果顯示:與正常組相比較，高糖組上清液MMP-2及MMP-9表達均增高(P＜0.05)，且MMP-2的增高較MMP-9更為顯著。Qu（25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L）組上清液MMP-2及MMP-9表達較正常組均減少，但表達量仍高于正常組（P＜0.05），且呈劑量依賴性。
　　結論:

12、　　1高糖環(huán)境可以抑制HUVECs的活性，影響血管內皮細胞;同時可以使MMP-2及MMP-9表達增多，影響血管基質代謝，從而破壞血管內膜的完整性，這可能與糖尿病引起的動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展有關。
　　2一定濃度下的Qu可在一定程度上提高HUVECs的活性，抑制高糖環(huán)境下MMP-2及MMP-9的表達。提示Qu可能通過提高HUVECs活性保護內皮細胞，通過抑制MMP-2及MMP-9的表達以穩(wěn)定高糖環(huán)境下血管基質的正常代謝，從而發(fā)揮保護血