介導(dǎo)NO信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的人可溶性鳥苷酸環(huán)化酶的表達(dá)純化及其結(jié)構(gòu)與性質(zhì)研究.pdf

1、一氧化氮(NO)于1992年被美國Science雜志評選為明星分子。1998年，美國的三位科學(xué)家(Furchgott RF，Ignarro LJ和Murad F)因發(fā)現(xiàn)“NO是心血管系統(tǒng)中一種重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子”而榮獲了諾貝爾生理和醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。至此以后，NO信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)越發(fā)受到人們的密切關(guān)注?？扇苄曾B苷酸環(huán)化酶(sGC)是介導(dǎo)NO信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的一個(gè)核心金屬蛋白，扮演著NO受體這一重要角色。NO結(jié)合到sGC后將激活sGC催化其底物GTP轉(zhuǎn)化為c

2、GMP。cGMP是我們所熟知的一個(gè)重要的二級(jí)信使分子，通過對其效應(yīng)蛋白的調(diào)節(jié)進(jìn)而在多種生理過程中起著重要的作用，例如促進(jìn)血管和平滑肌舒張；抑制血小板凝聚、血管重塑、細(xì)胞凋亡和炎癥發(fā)生以及參與神經(jīng)傳遞等等。一旦NO信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路異常，將會(huì)導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生，如多種心血管疾病(如肺動(dòng)脈高血壓、心力衰竭、動(dòng)脈粥樣硬化和再狹窄等)及神經(jīng)退行性疾病等。
　　 真核生物sGC是一個(gè)含b型血紅素，由α和β亞基組成的異源二聚體蛋白，每個(gè)亞基分別有

3、兩種異構(gòu)體形式(α1/α2和β1/β2)，其中以α1β1這種異源二聚體形式最為廣泛，研究也最多。按照同源序列和結(jié)構(gòu)功能的分析，α和β亞基都可以大致分為三大結(jié)構(gòu)域，分別是N-端血紅素結(jié)構(gòu)域(屬于H-NOX家族)、中間結(jié)構(gòu)域(也有將其細(xì)分為Per/Arnt/Sim(PAS)-like結(jié)構(gòu)域和螺旋卷曲(CC)結(jié)構(gòu)域)和C-端催化結(jié)構(gòu)域。其中血紅素結(jié)構(gòu)域是sGC研究的核心，因?yàn)樗切盘?hào)分子NO/CO等的調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域，信號(hào)小分子的調(diào)節(jié)機(jī)理研究對N

4、O信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)異常所引發(fā)的疾病診斷治療及新藥開發(fā)具有重要的指導(dǎo)意義，也是近年來化學(xué)生物學(xué)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。
　　 sGC的研究已歷經(jīng)三十多年，目前已有近5000篇文獻(xiàn)報(bào)道。但是許多關(guān)鍵問題尚未徹底解決，一直存在爭議。例如，血紅素是sGC活性調(diào)節(jié)的一個(gè)重要的輔基，但是它的結(jié)合區(qū)域及方式備受爭議；NO激活及失活機(jī)理也是眾說紛紜，仍無定論；α和β亞基異源二聚關(guān)鍵作用部位及其作用機(jī)理也尚待解決；sGC的晶體結(jié)構(gòu)更是鮮有報(bào)道。所有問題的一大源頭

5、就是能否獲取足量的蛋白。這么多年來sGC蛋白多數(shù)都是通過組織提取或者昆蟲細(xì)胞表達(dá)而得，但是這些方法蛋白的產(chǎn)量都不高，而且耗費(fèi)高，可以滿足對其活性的測定研究，但是在很大程度上它限制了sGC的深入研究，尤其是在分子水平上詳細(xì)研究其結(jié)構(gòu)-性質(zhì)-反應(yīng)關(guān)系。大腸桿菌一直都以高效率、低成本、高產(chǎn)量著稱，因此能否在大腸桿菌中成功的表達(dá)純化我們所需的sGC蛋白是該課題研究之初最大的挑戰(zhàn)。
　　 本論文的核心內(nèi)容是集中在對sGC血紅素結(jié)構(gòu)域的研究

6、。首先我們對人sGC(hsGC)β1亞基的N-端血紅素結(jié)構(gòu)域片段和全長蛋白(hsGCβ195，hsGCβ384和hsGCβ619)進(jìn)行了質(zhì)粒構(gòu)建及其在大腸桿菌中的表達(dá)與純化研究，成功建立了一套hsGC蛋白的高效表達(dá)與純化體系(產(chǎn)量約20 mg/L培養(yǎng)液)，解決了sGC研究中的第一大瓶頸問題，為之后的結(jié)構(gòu)-性質(zhì)-反應(yīng)研究奠定了很好的基礎(chǔ)。這一體系我們已經(jīng)申請了專利。通過同源結(jié)構(gòu)模擬及能量優(yōu)化我們得到了hsGCβ195蛋白的結(jié)構(gòu)模型。在血紅

7、素重組基礎(chǔ)上，我們對含血紅素的hsGC蛋白進(jìn)行了紫外可見光譜、EPR譜、圓二色光譜、熒光光譜的性質(zhì)研究，研究發(fā)現(xiàn)血紅素結(jié)構(gòu)域(hsGCβ195)可以作為一個(gè)很好的工具用以進(jìn)行sGC血紅素相關(guān)的性質(zhì)研究。變溫圓二色光譜結(jié)果表明hsGCβ195蛋白脫輔基和含血紅素形式的轉(zhuǎn)變中點(diǎn)溫度分別是56±1℃和54±3℃，說明兩種形式都具有較好的熱穩(wěn)定性。pH滴定實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示酸滴定和堿滴定的滴定中點(diǎn)(pKa)值分別為5.7±0.2和9.3±0.1，說明

8、hsGCβ195蛋白具有較好的堿穩(wěn)定性，但是在酸性條件下血紅素容易脫出，蛋白容易沉淀。hsGCβ195蛋白中只含有一個(gè)色氨酸(Trp22)，通過監(jiān)測Trp22內(nèi)源熒光光譜可以用來研究蛋白的構(gòu)象變化。Trp22熒光結(jié)果顯示：脫輔基hsGCβ195中Trp22處于比較疏水的環(huán)境，血紅素重組后熒光最大發(fā)射波長(λmax)紅移，熒光信號(hào)強(qiáng)度大幅度下降，說明蛋白的構(gòu)象發(fā)生了較大的變化，尤其是還原態(tài)和NO結(jié)合態(tài)，熒光信號(hào)幾乎完全淬滅。我們推測是血紅

9、素結(jié)合后引發(fā)第一個(gè)α螺旋(αA)構(gòu)象變化，使得Glu10(位于αA螺旋上)與Trp22相對位置改變并淬滅熒光。1-苯胺基萘-8-磺酸(ANS)是一個(gè)常用的疏水熒光探針，ANS外源熒光光譜結(jié)果顯示ANS可能會(huì)與血紅素部分競爭結(jié)合sGC疏水腔。
　　 為了探討血紅素的結(jié)合區(qū)域及作用方式，我們成功構(gòu)建并表達(dá)純化了α1亞基血紅素結(jié)構(gòu)域(hsGCα259)蛋白，并首次探索了其在血紅素結(jié)合、NO/CO結(jié)合上的性質(zhì)特征。同源結(jié)構(gòu)模擬及能量優(yōu)化

10、得到的hsGCα259同源結(jié)構(gòu)顯示該蛋白存在一個(gè)大的空腔，血紅素重組結(jié)果顯示血紅素可以穩(wěn)定結(jié)合到hsGCα259上，因此我們推測該空腔主要作用是用于血紅素的結(jié)合。EPR譜進(jìn)而證實(shí)α1和β1兩個(gè)亞基在結(jié)合血紅素的微環(huán)境上最大的區(qū)別在于β1亞基有一個(gè)近端軸向配體(His105)配位而α1亞基缺乏強(qiáng)的軸向配體。血紅素轉(zhuǎn)移及ANS外源熒光實(shí)驗(yàn)表明hsGCα259可能是通過強(qiáng)的疏水相互作用穩(wěn)定結(jié)合血紅素的。我們認(rèn)為：在異源二聚sGC蛋白中，α1和

11、β1亞基的N-端血紅素結(jié)構(gòu)域共同參與了血紅素的結(jié)合，其中β1亞基提供一個(gè)軸向配體(His105)與血紅素鐵配位，而α1主要是以疏水相互作用穩(wěn)定血紅素的結(jié)合。我們進(jìn)而研究了hsGCα259和hsGCβ195的CO和NO結(jié)合過程。在CO結(jié)合過程的穩(wěn)態(tài)平衡滴定和動(dòng)力學(xué)結(jié)果的基礎(chǔ)上我們提出了一個(gè)可能的CO結(jié)合模型。NO解離過程的研究表明NO解離是一個(gè)復(fù)雜的過程，需要用二級(jí)反應(yīng)進(jìn)行擬合，可能是由于NO結(jié)合態(tài)具有“open”和“closed”兩種構(gòu)

12、象，這兩種構(gòu)象在電子吸收光譜上沒有區(qū)別，但是在活性調(diào)節(jié)上有所區(qū)分。曾經(jīng)有報(bào)道推測hsGCα259蛋白的空腔是用于sGC激活劑(如YC-1)的結(jié)合，YC-1的結(jié)合會(huì)增加sGC對CO的親和力。但是我們CO滴定的結(jié)果顯示YC-1對CO結(jié)合沒有影響，等溫滴定量熱(ITC)測定結(jié)果也表明YC-1與hsGCa259并沒有強(qiáng)的相互作用。
　　 為了詳細(xì)研究軸向配位(Fe-H105)的作用，我們構(gòu)建了hsGCβ195H105G突變體蛋白并進(jìn)行詳

13、細(xì)的性質(zhì)表征。EPR譜證明該蛋白的確沒有了強(qiáng)的軸向配位。Trp22內(nèi)源熒光結(jié)果也顯示：His105突變前后脫輔基蛋白的構(gòu)象變化不大，但是血紅素重組后的蛋白構(gòu)象有明顯的改變。血紅素轉(zhuǎn)移和血紅素還原實(shí)驗(yàn)表明軸向配體(H105)對提高血紅素親和力的作用不大，但是它可以減緩血紅素氧化丟失進(jìn)而對蛋白起到一定的保護(hù)作用，這在生理過程中具有重要意義。基于氧化態(tài)及脫輔基sGC的藥物設(shè)計(jì)(sGC激活劑，sGC activator)是心血管疾病治療的另一思

14、路。
　　 為了研究異源二聚對血紅素結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)-性質(zhì)-反應(yīng)的影響，我們通過添加linker的方式將α1和β1兩個(gè)亞基血紅素結(jié)構(gòu)域連接起來，構(gòu)建出了一個(gè)新的蛋白質(zhì)(hsGCβ195-α259)并對其進(jìn)行了詳細(xì)的表征。圓二色光譜及Trp22內(nèi)源熒光光譜結(jié)果都表明該蛋白與單個(gè)亞基相比發(fā)生了很大的構(gòu)象變化，并具有很好的穩(wěn)定性。血紅素重組及EPR譜結(jié)果顯示：hsGCβ195-α259能夠穩(wěn)定結(jié)合血紅素，但是其結(jié)合方式與α1亞基相似，其序

15、列中的His105并沒有與血紅素軸向配位。我們推測hsGCβ195-α259中血紅素構(gòu)象存在兩種可能性：一是血紅素主要還是結(jié)合在β195的疏水腔里，添加linker及α259后β195與α259相互作用使得蛋白構(gòu)象發(fā)生一定的變化，血紅素遠(yuǎn)離H105，從而無法配位；另一種方式是linker的添加使得血紅素進(jìn)入β195的入口受阻，血紅素主要結(jié)合在α259的疏水空腔，血紅素與H105距離較遠(yuǎn)而無法配位，但是血紅素具體的結(jié)合方式還有待于進(jìn)一步的

16、實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證或者晶體結(jié)構(gòu)的解析。對CO結(jié)合和NO解離過程的研究表明：hsGCβ195-α259蛋白與單個(gè)亞基相比，CO親和力增加了近一倍，NO解離速率加快了約一倍。除此之外，我們還將β195和α259同時(shí)構(gòu)建到pETDuet-1載體中以實(shí)現(xiàn)兩個(gè)亞基的共表達(dá)。Amylose和Ni-NTApull-down實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明這兩個(gè)亞基在體內(nèi)的確存在相互作用。而分別表達(dá)純化的β195和α259在體外混合后卻不能發(fā)生相互作用形成異源二聚蛋白。這一結(jié)果一方

17、面說明sGC的血紅素結(jié)構(gòu)域?qū)Ξ愒炊劬哂幸欢ǖ呢暙I(xiàn)，同時(shí)也反映出sGC異源二聚可能是由體內(nèi)信號(hào)調(diào)節(jié)完成的。
　　 最后，我們還對sGC血紅素結(jié)構(gòu)域在晶體學(xué)方面進(jìn)行了初步研究。經(jīng)過大量的結(jié)晶條件篩選及多次嘗試，最終我們成功培養(yǎng)出了hsGCβ195-α259和hsGCβ195H105G-α259突變體的脫輔基及含血紅素形式蛋白的多種晶體，并已經(jīng)獲得晶體衍射數(shù)據(jù)，結(jié)構(gòu)的解析工作正在進(jìn)行中。晶體結(jié)構(gòu)的解析將為理解sGC的血紅素結(jié)合方式、