人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞在高糖環(huán)境下胱硫醚-γ-裂解酶合成減少的機(jī)制.pdf

1、目的：
　　糖尿病的并發(fā)癥都會給人生活帶來不方便，其中血管并發(fā)癥的影響非常重要.最近的研究發(fā)現(xiàn)高血糖還可以通過影響內(nèi)源性H2S的產(chǎn)生引起血管病變。
　　體內(nèi)H2S的產(chǎn)生和含硫氨基酸代謝的有關(guān)。產(chǎn)生硫化氫的主要三個酶是胱硫醚-γ-裂解酶(cystathionine-γ-lyase，CSE)、3-巰基丙酮酸轉(zhuǎn)硫酶（3-mercaptopyruvate sulfur transferase，3MST）和胱硫醚-β-合成酶(cyst

2、athionine-β-synthase，CBS)。在體內(nèi)的H2S主要以NaHS和物理溶解的H2S氣體兩種方式存在。氣體形式占總量的1/3，NaHS約占體內(nèi)H2S總量的2/3。
　　生理狀態(tài)下H2S的作用很多。內(nèi)源性H2S通過增強(qiáng)門冬氨酸受體的活性易化了海馬長時程增強(qiáng)作用。星形膠質(zhì)細(xì)胞是形成和調(diào)節(jié)突觸的細(xì)胞，H2S還可以引起星形膠質(zhì)細(xì)胞Ca2+內(nèi)流。通過既調(diào)節(jié)神經(jīng)元又調(diào)節(jié)膠質(zhì)細(xì)胞，H2S可以調(diào)控神經(jīng)突觸的活性。
　　在異常情

3、況下如高血糖狀態(tài)，H2S在心血管組織作用的變化成了血管病變的機(jī)制之一。前期的研究發(fā)現(xiàn)在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中高血糖上調(diào)過氧化物酶的活性引起活性氧水平的上升，上調(diào)Bcl-2相關(guān)X蛋白異源異構(gòu)體(Bax/Bcl-2)的比例，激活半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)，而提前加入外源性的硫氫化鈉可以預(yù)防這些變化。但是前期的研究發(fā)現(xiàn)在高血糖時內(nèi)皮細(xì)胞的H2S的合成是減少的，因此H2S的血管保護(hù)作用就要減弱。那么為什么在高血糖的環(huán)境下，H2S的合成

4、就會減少呢，或者說，減少的機(jī)制是什么？現(xiàn)在進(jìn)行的研究就是來進(jìn)行這一方面的探討。
　　研究方法：
　　1.細(xì)胞培養(yǎng):選取健康足月分娩的在濟(jì)南市第五人民醫(yī)院或者山東大學(xué)附屬山東省立醫(yī)院孕婦臍帶，分離出靜脈內(nèi)皮細(xì)胞作為實驗對象。本實驗已經(jīng)通過山東大學(xué)倫理委員會的討論同意。試驗前告知產(chǎn)婦并簽署知情同意書。在臍靜脈中灌入0.125％胰酶+0.1％EDTA混合溶液，10分鐘后內(nèi)皮細(xì)胞就會脫落下來。培養(yǎng)細(xì)胞用加入青鏈霉素雙抗、重組牛成纖維

5、細(xì)胞生長因子、胎牛血清的M199培養(yǎng)液。
　　2.細(xì)胞處理:采用50％右旋葡萄糖為細(xì)胞提供高葡萄糖環(huán)境，需要加入培養(yǎng)基的量由設(shè)計的公式算出。抑制磷酸化的p38MAPK作用的抑制劑選用SB203580。
　　3.實時熒光定量PCR
　?、賹⒂糜谠囼灥募?xì)胞拿出孵箱，用冷的PBS洗皿2-3次。加入Trizol1ml，裂解細(xì)胞，裂解液放入EP管中。
　?、诿總€EP管內(nèi)加入200μl氯仿，劇烈震蕩30秒鐘，室溫靜置15分鐘

6、;再次震蕩30秒鐘，室溫靜置15分鐘。
　?、垲A(yù)冷低溫離心機(jī)，使離心溫度能維持在4℃。離心后EP管內(nèi)液體分為三層。上層的水相含有RNA;中間一層白色沉淀含有蛋白和DNA;下層除了含有蛋白和RNA還有紅色苯酚和氯仿。
　?、苄⌒奈∩蠈铀嘀亮硪恍翬P管，加入等體積的異丙醇顛倒混勻，室溫靜置5-10分鐘。
　　⑤靜止后再次放入4℃離心機(jī)離心10分鐘，管底可以見到白色沉淀，即為RNA沉淀。
　?、薜箺壣锨?。用DEPC

7、水配制的75％乙醇洗滌剩余RNA沉淀，洗滌時同樣注意避免將RNA洗出試管外。
　?、咴俅坞x心、洗滌2次，吸去大部分上清液，室溫下在通風(fēng)櫥內(nèi)放置5-10分鐘。不能徹底干燥，至沉淀變?yōu)闈駶櫟陌胪该靼咨珵橹?，干燥過度會使溶解度降低，降低OD260/280的比值。
　?、嗍褂肈EPC水逐步小量稀釋，至沉淀完全溶解。取2μl用于測定RNA濃度，以O(shè)D260/280的比值確定RNA的純度，所用樣品的比值均要求在1.8-2.2之間，否則棄

8、用。
　　⑨將提取的mRNA加入gDNA Eraser進(jìn)行去基因組反應(yīng)，然后配制反轉(zhuǎn)錄體系，將mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。
　?、鈱⒏鹘M的cDNA和SybrGreen配成混合物，將設(shè)計好的引物和去離子水配成混合物，然后進(jìn)行熒光實時定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后記錄好各個樣品的cp值，比較各組2-△△cp的差異。
　　4.Western Blot檢測蛋白質(zhì)的表達(dá)
　　①準(zhǔn)備好冰盒，取經(jīng)過處理好的細(xì)胞放置冰上操作。吸去培養(yǎng)

9、基，加入冷的PBS清洗3遍。每個直徑60mm的培養(yǎng)皿加入80-100μl蛋白提取液。
　　②用細(xì)胞刮子將細(xì)胞刮進(jìn)蛋白提取液，然后轉(zhuǎn)移至EP管冰上裂解30分鐘。
　?、郾狭呀馔旰笤偈褂贸暳呀饧?xì)胞。超聲探頭不能碰觸EP管壁及底部，探頭在進(jìn)入EP管前要劑用酒精和純水清洗干凈，以避免產(chǎn)生其他蛋白污染。
　?、艹暳呀夂蠓湃?攝氏度低溫離心機(jī)，離心后取上清液。
　?、菹♂屘崛〉募?xì)胞蛋白濃度，配置AB液，通過BCA法測定

10、蛋白濃度。計算上樣量。打開水浴鍋，將需要上樣的蛋白變性。
　?、夼渲齐娪揪彌_液，配制好膠，把已經(jīng)灌好膠的膠板放入電泳槽，進(jìn)行預(yù)電泳。電泳槽中間的緩沖液一定要沒過薄板，否則會出現(xiàn)導(dǎo)電不良。然后垂直向上拔出梳子，避免破壞加樣孔。上樣:先在一個梳子孔中注入蛋白marker2-5μl，然后將蛋白質(zhì)樣品根據(jù)計算好的上樣量注入各個梳子孔中。
　　⑦電泳:先跑第一階段，條件是30伏特，60分鐘。這樣可以把蛋白樣品在上層膠里面壓成一條線。第

11、二階段電壓是100伏特，根據(jù)不同的分子量選擇不同的時間。
　　⑧轉(zhuǎn)膜:在托盤中倒入適量的轉(zhuǎn)膜緩沖液，要使倒入的液體能夠沒過夾子和纖維布。內(nèi)參選取的是GAPDH（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenas，甘油醛-3-磷酸脫氫酶），根據(jù)目的蛋白和內(nèi)參蛋白的分子大小進(jìn)行膠的切割。對于內(nèi)參GAPDH和CSE選擇恒壓100伏特，40分鐘。MAPK-14和磷酸化的MAPK-14，轉(zhuǎn)膜條件相同。對于分子量較

12、大的Sp1和磷酸化的Sp1轉(zhuǎn)膜條件是100伏特，70分鐘。
　?、岱跤豢购投埂?br>　?、怙@影。
　　5.染色質(zhì)免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation)
　　①活細(xì)胞的交聯(lián)和裂解:取出培養(yǎng)皿（培養(yǎng)皿使用直徑15cm的大皿，加入20ml的培養(yǎng)液）加入550μl甲醛(37％)溶液，輕搖混勻，室溫下靜置10分鐘。清洗后，加入2ml含有CocktailⅡ的PBS，用細(xì)胞刮刀將細(xì)胞刮到1個E

13、p管內(nèi)，加入裂解液，然后進(jìn)行超聲剪切DNA。
　　②蛋白-DNA免疫共沉淀:準(zhǔn)備三個Ep管，每個管內(nèi)加入100μl剪切好的DNA-蛋白質(zhì)懸液，加入900μl的dilution buffer，加入Sp1的抗體，經(jīng)過多次離心、洗滌之后留取沉淀物，即為蛋白-DNA共沉淀物。
　?、鄣鞍?DNA復(fù)合物的洗脫:input管加200μl配制好的洗脫緩沖液，然后在室溫下放置等待后面的步驟使用。其余3管每個加入100μl，室溫孵育15分鐘，

14、重新離心，去除離心的沉淀物;然后取上清液再次每管加入100μl緩沖液重復(fù)上一步驟洗滌，最后得到200μl液體。
　?、苡坞xDNA:對所有的樣本，依次加入5mol/L NaCl8μl，1μlRNase，4μl0.5mol/L EDTA溶液，8μl1mol/L的Tris-HCl和1μl proteinase K，并經(jīng)過適當(dāng)孵育。
　?、菔褂梦街兓疍NA:拿出4個吸附柱和4個收集管。將上一步中孵育好的4個Ep管加入結(jié)合劑，通過

15、多次離心過濾得到的濾出液就是需要獲得的DNA。
　?、轕CR:將獲得的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增出來的條帶進(jìn)行分析。
　　結(jié)果：
　　1.在高血糖環(huán)境下內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)CSE蛋白無論在11.1、16.7或是25mmol/L的葡萄糖濃度下，48小時后就觀察到CSE的蛋白合成量下降，與正常葡萄糖組相比，各個高葡萄糖濃度組的CSE表達(dá)均下降(P＜0.05)。
　　2.RT-PCR的結(jié)果顯示，在不同的葡萄糖濃度下，CSE的m

16、RNA水平是不同的。高葡萄糖濃度處理48小時后，11.1、16.7或是25mmol/L的葡萄糖濃度組CSE的mRNA水平有了不同程度的下降，與正常葡萄糖濃度組相比差別均有顯著性(P＜0.05)。這提示CSE合成的下降是在轉(zhuǎn)錄水平開始的。
　　3.CHIP試驗結(jié)果顯示input組顯示陽性，實驗組是加入Sp1抗體的組，也是陽性，AC組和NC組結(jié)果分別是陽性和陰性。這樣的結(jié)果說明Sp1結(jié)合在CSE基因的起始轉(zhuǎn)錄點附近。
　　4.對

17、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞在正常血糖和高血糖狀態(tài)下進(jìn)行western blot檢測發(fā)現(xiàn)在高血糖狀態(tài)下Sp1的總量沒有增加而是磷酸化水平增加，p38MAPK的磷酸化水平也在增加（P均小于0.05）。給予SB203580阻斷磷酸化的p38MAPK的功能后，Sp1磷酸化和CSE的變化消失。
　　結(jié)論：
　　1.在葡萄糖濃度升高的環(huán)境下，CSE的表達(dá)是下降的，并且這種下降在轉(zhuǎn)錄水平上就發(fā)生了。
　　2.在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中，Sp1是CS