封閉人群兒童口腔微生物與齲病關(guān)系的宏基因組分析.pdf

1、齲病是口腔最常見的慢性感染性疾病之一，任何國家、任何民族不能幸免，尤以兒童和老年人發(fā)病率高。微生物微妙地維護(hù)著人類口腔生態(tài)平衡和機(jī)體健康，同時(shí)作為公認(rèn)的致齲因素，在齲病發(fā)生發(fā)展中扮演不可缺少的重要角色。微生物的致齲機(jī)理研究經(jīng)歷的100多年歷程中，非特異菌斑假說、特異菌斑假說、生態(tài)菌斑假說、連續(xù)流假說體現(xiàn)了人類對(duì)齲病微生物的認(rèn)識(shí)不斷進(jìn)步和深入。而以往人類口腔檢出的700多種細(xì)菌，一半以上尚不能培養(yǎng)，在復(fù)雜的口腔微生態(tài)環(huán)境中，我們的認(rèn)識(shí)只是

2、冰山一角，對(duì)齲病病因的研究任重而道遠(yuǎn)。以DNA為基礎(chǔ)的一系列現(xiàn)代生物技術(shù)研究方法，尤其是高通量測(cè)序，使我們能在微生物組層面靈敏探測(cè)疾病相關(guān)微生物的變化。本課題組前期提出齲病微生物連續(xù)流動(dòng)態(tài)假說，利用基于細(xì)菌16S rRNA的基因芯片微陣列技術(shù)橫向和縱向研究了開放人群和封閉人群不同齲敏感兒童個(gè)體口腔微生物組的多樣性和差異，探索了致齲動(dòng)物在齲病發(fā)生發(fā)展過程中口腔部分微生物的演替及致齲毒力變化。芯片微陣列基于已知菌屬基因序列的探針雜交，獲得的

3、細(xì)菌種類有限，對(duì)未知菌屬無法評(píng)估，而454焦磷酸測(cè)序GS-FLX Titanium系統(tǒng)，對(duì)基因組深度測(cè)序極具優(yōu)勢(shì)?！昂诵奈⑸锝M”是指人體某個(gè)生境的某些微生物或功能性基因存在于大部分或全部受檢人群中人體，人體是否存在核心微生物組沒有定論。NIH2007年發(fā)布了核心微生物組計(jì)劃，檢測(cè)人體5個(gè)不同部位(口腔、鼻腔、皮膚、胃腸道和女性陰道)是否存在核心微生物組，確定其變化對(duì)人體健康和疾病的影響。課題組前期工作在芯片微陣列的研究基礎(chǔ)上初步提出了

4、對(duì)口腔核心微生物組的支持。
　　 目的：本研究在前期系列研究基礎(chǔ)上，以封閉人群兒童為研究對(duì)象，利用基于細(xì)菌16S rRNAV1-V3區(qū)PCR擴(kuò)增的454焦磷酸GS-FLX Titanium測(cè)序，從門、綱、目、科、屬、種(OTU)水平對(duì)80個(gè)高齲無齲兒童與齲病密切相關(guān)的兩個(gè)重要生態(tài)環(huán)境--菌斑生物膜和唾液微生物進(jìn)行宏基因組分析，從生態(tài)學(xué)宏觀層面探討齲病相關(guān)差異微生物組，驗(yàn)證生態(tài)菌斑假說，為課題組提出的連續(xù)流動(dòng)態(tài)假說提供依據(jù)、為口腔

5、核心微生物組提供支持、為齲病病因?qū)W研究和生態(tài)防治提供新的方向。
　　 方法：符合WHO取樣標(biāo)準(zhǔn)的30名高齲和10名無齲兒童，取同一個(gè)體的無刺激性唾液和磨牙牙菌斑，提取全基因組DNA行16S rDNA V1-V3區(qū)PCR擴(kuò)增并構(gòu)建文庫，加入標(biāo)簽序列和A、B接頭后行油包水PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物定量均一化后上機(jī)測(cè)序。所得序列進(jìn)行一系列去雜后得到優(yōu)質(zhì)序列與SILVA數(shù)據(jù)庫比對(duì)(80％ID)，MOTHUR軟件評(píng)估微生物多樣性，ITOL軟件構(gòu)建系

6、統(tǒng)發(fā)育樹，使用聚類分析、單因素方差分析等進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　 結(jié)果：(1)菌斑和唾液共80樣本共得到856，663條序列，其中優(yōu)質(zhì)序列占507，502條(60％)，每個(gè)樣本平均約含6347條序列，每條序列平均長度425bp。(2)80樣本共檢到15003種水平上的OTUs，歸屬于18個(gè)門，29個(gè)綱，44個(gè)目，74個(gè)科，129個(gè)屬；其中菌斑含11015，歸屬于13個(gè)門和118種屬；唾液含7509 OTUs，屬于18個(gè)門129種屬

7、。(3)每個(gè)菌斑樣本中微生物種型的數(shù)量范圍：706至1272種(均數(shù)：781)；每個(gè)唾液微生物種型和數(shù)量范圍：441至973種(均數(shù)：773.8)；菌斑和唾液每個(gè)樣本所含微生物多樣性無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。(4)16個(gè)差異菌屬在高齲菌斑組檢出率高于無齲菌斑組(P<0.05)，其中包含6個(gè)優(yōu)勢(shì)菌屬(檢出率>1％)，如纖毛菌屬(Leptotrichia)，普氏菌屬(Prevotlla)，鏈球菌屬(Streptococcus)，韋榮菌屬

8、(Veillonella)，放線菌屬(Actinomyces)和毛單胞菌屬(Comamonas)；19個(gè)差異菌屬在無齲菌斑組檢出率高于高齲菌斑組(P<0.05)，包含6個(gè)優(yōu)勢(shì)菌屬(檢出率>1％)，如奈瑟菌屬(Neisseria)，卟啉單胞菌屬(Porphyromonas)月形單胞菌屬(Selenomonas)，德克斯氏菌屬(Derxia)，Aggregatibacter菌屬(Aggregatibacter)和孿生菌屬(Gemella)。

9、(5)在唾液組中，29個(gè)差異菌屬在高齲唾液組的檢出率高于無齲唾液組(P<0.05)，包含7個(gè)優(yōu)勢(shì)菌屬(檢出率>1％)，如鏈球菌屬(Streptococcus)，普氏菌屬(Prevotella)，羅氏菌屬(Rothia)，顆粒鏈球菌屬(Granulicatella)，孿生菌屬(Gemella)，營養(yǎng)缺乏菌屬(Abiotrophia)，伯杰菌屬(Bergeyella)；13個(gè)差異菌屬在無齲唾液組檢出率高于高齲唾液組(P<0.05)，如奈瑟菌

10、屬(Neisseria)，卟啉單胞菌屬(Porphyromonas)，韋榮氏菌屬(Veillonella)，纖毛菌屬(Leptotrichia)等。(6)主成分分析顯示，在口腔菌斑和唾液兩個(gè)不同的生境中，二者微生物組成集中在兩個(gè)不同的區(qū)域可能存在較大差異。(7)在30高齲菌斑和10無齲菌斑樣本中，有18個(gè)菌屬在所有菌斑樣本都能檢出并且占到約90％的菌斑序列，如放線菌屬(Actinomyces)，Aggregatibacter，石胡荽菌屬

11、(Centipeda)，二氧化碳嗜纖維菌屬(Capnocytophaga)，心桿菌屬(Cardiobacterium)，棒狀桿菌屬(Corynebacterium)，德克斯氏菌屬(Derxia)，梭桿菌屬(Fusobacterium)，孿生菌屬(Gemella)，顆粒鏈球菌屬(Granulicatella)，Johnsonella，纖毛菌屬(Leptotrichia)，奈瑟菌屬(Neisseria)，卟啉單胞菌屬(Porphyromon

12、as)，普氏菌屬(Prevotella)，月形單胞菌屬(Selenomonas)，鏈球菌屬(Streptococcus)，韋榮菌屬(Veillonella)；有16個(gè)菌屬在30高齲唾液和10無齲唾液樣本中都能檢出并且占到約85-98％的唾液序列，如營養(yǎng)不足菌屬(Abiotrophia)，放線菌屬(Actinomyces)，伯杰菌屬(Bergeyella)，德克斯氏菌屬(Derxia)，孿生菌屬(Gemella)，二氧化碳嗜纖維菌屬(Ca

13、pnocytophaga)，羅氏菌屬(Rothia)，顆粒鏈球菌屬(Granulicatella)，嗜血桿菌屬(Haemophilus)，Johnsonella，纖毛菌屬(Leptotrichia)，奈瑟菌屬(Neisseria)，普氏菌屬(Prevotella)，卟啉單胞菌(Porphyromonas)，鏈球菌屬(Streptococcus)，韋榮菌屬(Veillonella)；其中13個(gè)菌屬和TM7門在80菌斑和唾液樣本中都能檢出，

14、如放線菌屬(Actinomyces)，二氧化碳嗜纖維菌屬(Capnocytophaga)，德克斯氏菌屬(Derxia)，孿生菌屬(Gemella)，顆粒鏈球菌屬(Granulicatella)，Johnsonella，纖毛菌屬(Leptotrichia)，奈瑟菌屬(Neisseria)，卟啉單胞菌屬(Porphyromonas)，普氏菌屬(Prevotella)，鏈球菌屬(Streptococcus)，Selenomonas，韋榮氏菌屬

15、(Veillonella)。此外，在種(OTU)的水平上，有15個(gè)OTUs是所有菌斑樣本共有；有19個(gè)OTUs是所有唾液樣本共有。
　　 結(jié)論：(1)454焦磷酸測(cè)序分析口腔微生物宏基因組與較前期使用的基因芯片技術(shù)，獲得極為豐富的生物信息，發(fā)現(xiàn)更多未知的疾病相關(guān)菌；(2)封閉人群兒童口腔微生物組多樣性高于唾液微生物多樣性；(3)牙菌斑和唾液微生物的檢出率在高齲與無齲人群存在很大差異，多種檢出率高或低的菌屬與齲病的發(fā)生可能存在正相