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文檔簡介
1、高質(zhì)量深海沉積物DNA提取是進行深海微生物分子生態(tài)學研究和宏基因組文庫構(gòu)建的一個重要而且關鍵的環(huán)節(jié)。本研究以中國南海東沙群島北海海域深海沉積物為研究對象,采用玻璃珠裂解法、酶解法、化學裂解法和商品化環(huán)境基因組分離試劑盒等方法提取沉積物總DNA,用PCR-DGGE技術評價不同提取方法對沉積物DNA多樣性的影響,并在此基礎上改進了DNA提取方法,提取的DNA完整性更好產(chǎn)率更高,并表現(xiàn)出較好的基因組多樣性。該方法的建立為本文深海沉積物微生物多
2、樣性調(diào)查和宏基因組文庫的構(gòu)建奠定了較好的基礎。 本研究利用分子生物學技術,以不依賴培養(yǎng)的方式對東沙群島北海海域深海沉積物的細菌和真菌的群落組成進行了研究。采用細菌16SrRNA基因通用引物16(+)/1492r構(gòu)建了3種深度沉積物的細菌16SrRNA基因文庫,并進行擴增rDNA限制性酶切片段分析(ARDRA),對其中優(yōu)勢條帶進行了測序和系統(tǒng)發(fā)育分析。結(jié)果顯示三種深度的細菌16SrRNA基因序列分布在Proteobacteria、
3、Cytophaga-Flexibacter-Bacteroides(CFBs)、Planctomycetes、Acidobacteria等類群。其中,三個深度沉積物中都是以proteobacteria為優(yōu)勢群落,不同之處在于B深度樣品和H深度樣品都是以gamma-proteobacteria為優(yōu)勢類群,E樣品是alpha-和gamma-proteobacteria占有較大比例。此外,在E和H深度樣品中檢測到Beta-proteobact
4、eria,而B深度樣品中沒有檢測到。Planctomycetes類群只在E深度樣品中檢測到。H深度樣品中檢測到了Acidobacteria和豐富的CFBs類群,在其它兩個深度樣品中沒有檢測到。 首次采用真菌間隔區(qū)序列(ITS)對中國南海具備水合甲烷形成條件的深海沉積物真菌群落結(jié)構(gòu)進行了研究,構(gòu)建5個真菌rRNA基因間隔區(qū)序列ITS文庫,進行ARDRA分析和ITS序列系統(tǒng)發(fā)育分析。已測序的25種OTU分型的ITS-rRNA序列BL
5、AST結(jié)果顯示,最相似序列分別歸屬于莖點霉屬(Phoma),路德酵母屬(Lodderomyces),馬來西亞屬(Malassezia),隱球菌屬(Cryptococcus),柱孢屬(Cylindrocarpon),Hortaea,畢赤氏酵母(Pichia),曲霉屬(Aspergillus)和假絲酵母(Candida)等。系統(tǒng)發(fā)育分析表明,25種OTU分型可分為三種類型:第一種類型的序列占了全部種類的20%,這類序列主要和一些可培養(yǎng)的種屬
6、相關;第二種類型的序列占了全部類型的76%。這部分序列同GenBank搜索的最相似序列的相似性都小于94%,但在系統(tǒng)發(fā)育樹上能較好地聚在一起。大部分序列都歸屬于酵母分枝;第三種類型只占其中很小一部分,只有4%,這些序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中沒有找到和其最相似序列,在系統(tǒng)發(fā)育樹上也不能較好聚類。 首次構(gòu)建pET30表達系統(tǒng)的深海沉積物宏基因組文庫。文庫克隆平均插入片段為1.2kb,轉(zhuǎn)化效率為2.3×107個/μgDNA克隆。結(jié)合
7、SDS-PAGE分析從pET30a表達文庫篩選得到假定RNaseHI基因,序列比對顯示,該編碼序列與來源于Alpha-proteobacteria的Sulfitobactersp.EE-36具有最高相似性(98%)。該編碼序列具有RNaseHI酶的保守位點(Asp10,Glu48,Asp70,His124和Asp134),預示假定酶的結(jié)構(gòu)與功能類似于RNaseHI。結(jié)果證明利用強啟動子構(gòu)建宏基因組文庫并結(jié)合SDS-PAGE電泳分析能夠有
8、效篩選出具有蛋白表達的克隆,避免了那些有表達而無活性克隆或表達有活性卻不能分泌到胞外的克隆漏篩。 構(gòu)建了以pUC19為克隆載體的深海沉積物宏基因組文庫,插入片段平均大小為6.2kb,其中73%的插入片段在4~8kb之間。根據(jù)估算,每微克DNA得到的克隆為5000~10000個。從文庫中隨機挑取克隆進行序列分析。分析克隆pUC19-14插入序列,結(jié)果顯示其中的開放閱讀框架(ORF)編碼的是一種跨膜蛋白,該家族蛋白有些與機體耐藥性相
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