刺五加酸激活LXR信號通路改善肝纖維化的研究.pdf

1、目的：刺五加酸是由刺五加的根皮部提取的一種海松二烯二萜類物質(zhì)，前期研究發(fā)現(xiàn)其具有較好的肝保護作用，本研究采用四氯化碳誘導小鼠肝纖維化模型和活化肝星狀細胞，探討刺五加酸對肝纖維化的改善作用以及具體的調(diào)控機制。
　　方法：通過腹腔注射10％四氯化碳橄欖油溶液2 ml/kg，前4周每周2次，后4周每周1次，連續(xù)8周，制作小鼠肝纖維化模型。分別灌胃給予小鼠不同劑量（20 mg/kg或50 mg/kg）的刺五加酸，每周3次，連續(xù)8周。采集血

2、清和肝臟存于-80℃。用自動生化分析儀測定血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）及腫瘤壞死因子（TNF-α）活性的變化。應用H＆E、Masson、免疫組化3種方法染色，觀察肝組織病理學改變。檢測α-SMA、Collagen-I、MMP-13、TIMP-1、LXRs和NF-кB/IкB-α的蛋白表達水平。
　　取對數(shù)生長期大鼠肝星狀細胞，用TGF-β（5ng/ml）刺激2 h后，分別給予不同濃度（1、3、10

3、μmol/l）的刺五加酸孵育24 h，收集細胞，提取細胞總蛋白和細胞核蛋白進行蛋白免疫印跡分析，測定α-SMA與LXRs的蛋白表達水平。
　　GW3965是人工合成的LXR激動劑，研究表明LXR激動劑能夠抑制小鼠巨噬細胞內(nèi)多種炎癥性調(diào)節(jié)器的表達。取對數(shù)生長期人的肝星狀細胞，分別給予不同濃度（0.125、0.25、0.5、1、2μM）的LXRs激動劑GW3965孵育18 h，測定LXRs蛋白隨劑量變化的表達水平；取對數(shù)生長期人的肝星

4、狀細胞，給予不同濃度（1、3、10、20μmol/l）的刺五加酸和2μM的GW3965孵育18 h，然后用LPS（1μg/ml）刺激30 min，測定LXRs、α-SMA、Collagen-I、TIMP-1、NF-кB/IкB-α的蛋白表達水平。
　　結果：在體內(nèi)實驗中，與四氯化碳模型組相比，刺五加酸抑制了四氯化碳導致的肝纖維化小鼠血清中ALT、AST、TNF-α活力的升高；刺五加酸抑制了四氯化碳誘導的α-SMA、Collagen

5、-I的表達，同時調(diào)整了 MMP-13/TIMP-1的比率；刺五加酸顯著上調(diào)了LXRα和LXRβ的表達，同時抑制了NF-κB的核轉(zhuǎn)錄。
　　在體外實驗中，刺五加酸在一定濃度范圍內(nèi)（0.78-5 ng/ml）對肝星狀細胞只有較低的細胞毒性；刺五加酸能夠明顯抑制TGF-β刺激的α-SMA的表達，具有劑量依賴性，同時刺五加酸劑量為3-10μM時顯著增加了LXRβ的表達。
　　GW3965為人工合成的LXRs激動劑，與正常組相比，0.

6、125-2μM的GW3965能顯著增強LXR活化，并呈劑量依賴性，其中濃度為2μM時活化效果更為顯著；與正常組相比，給予活化的人的肝星狀細胞不同濃度（1、3、10、20μM）的刺五加酸和2μM GW3965時，劑量為3、10、20μM的刺五加酸和2μM GW3965能夠明顯降低α-SMA的蛋白水平，20μM刺五加酸和2μM GW3965能夠顯著降低Collagen-I的蛋白水平，而劑量為3、10、20μM的刺五加酸和2μM GW3965

7、能夠明顯降低TIMP-1的蛋白水平；劑量為10、20μM的刺五加酸和2μM GW3965能夠促進NF-кB p65從細胞漿轉(zhuǎn)錄到細胞核，細胞核中NF-кB p65的表達明顯增多，而細胞漿中NF-кB p65的表達明顯減少。劑量為1、3、10、20μM的刺五加酸和2μM GW3965促進IкB-α發(fā)生磷酸化，且呈劑量依賴性。
　　結論：刺五加酸可能通過激活LXRα和LXRβ抑制NF-κB的核轉(zhuǎn)錄進而改善四氯化碳誘導的肝纖維化，并且通