金黃色葡萄球菌表面蛋白表達(dá)及菌體檢測方法初步建立.pdf

1、金黃色葡萄球菌的感染已經(jīng)成為世界的焦點(diǎn)問題，因?yàn)樗粌H嚴(yán)重威脅著人類的健康，還造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。金葡菌是引起人類化膿感染的重要致病菌，也是引起食物污染和細(xì)菌性食物中毒的一種重要細(xì)菌。該菌在自然界中無處不在，因此污染食品的幾率較大。食品被污染后，在適合的溫度條件下，金黃色葡萄球菌將大量繁殖并產(chǎn)生腸毒素，從而引起消費(fèi)者食物中毒。因此，建立金黃色葡萄球菌的快速檢測方法具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。本研究以表面蛋白為檢測靶標(biāo)，初步建立了雙抗體夾心EL

2、ISA檢測方法，為金黃色葡萄球菌快速檢測方法在食品安全檢測、臨床檢驗(yàn)等方面的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
　　本研究首先根據(jù)表面蛋白IsdA和SdrD基因設(shè)計(jì)特異性引物，以金葡菌標(biāo)準(zhǔn)菌株基因組為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分別獲得了大小為801bp與2043bp的基因片段。將基因片段連接至表達(dá)載體pET26b，轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)中進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。SDS-PAGE結(jié)果表明，兩種基因在宿主細(xì)胞中均能夠較好的表達(dá)，重組蛋白的分子量大小分別

3、約為38kDa和99kDa。利用免疫親和層析對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行純化，并分別免疫新西蘭白兔和白拉克母雞，制備多克隆抗體。利用純化的IsdA雞源多抗(IsdA-IgY)作為捕獲抗體、SdrD兔源多抗(SdrD-IgG)作為檢測抗體，初步完成金黃色葡萄球菌雙抗體夾心ELISA方法的建立。優(yōu)化的最佳檢測條件為:捕獲抗體IsdA-IgY包被量為2μg/well，檢測抗體稀釋倍數(shù)為500倍，封閉液為1×PBS的0.5％的脫脂乳粉，酶標(biāo)二抗的稀釋倍數(shù)為1

4、0000倍。檢測方法對(duì)于三株金黃色葡萄球菌分型菌株（ATCC49525、ATCC49521和ATCC55804）的檢測限(LOD)分別為1.44×107cfu/mL、9.14×106cfu/mL、7.14×106cfu/mL，定量限(LOQ)分別為5.74×107cfu/mL、3.59×107cfu/mL、3.29×107cfu/mL。通過對(duì)雙抗體夾心ELISA方法板內(nèi)和板間變異程度的檢測，表明本研究所建立的方法具有良好的穩(wěn)定性。用此方