金黃色葡萄球菌GapC蛋白的表達(dá)與免疫原性研究.pdf

1、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus.aureus，S. aureus)是引起人和動(dòng)物多種疾病的重要致病菌。由于不同S. aureus菌株間缺乏共同的保護(hù)性抗原，目前研究的S. aureus疫苗在臨床試驗(yàn)中應(yīng)用效果并不理想。研究表明甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)蛋白可作為抗寄生蟲和微生物感染的疫苗抗原。因而，本研究利用S. aureus表面具有GAPDH活性的保守性GapC蛋白制備免疫原，探討其免疫原性，及其對S.aure

2、us感染的免疫保護(hù)作用。 本研究首先通過PCR方法擴(kuò)增S.aureus菌株。BMSA/855/23-1的gapC基因，隨后將其克隆到pMD18-T載體上。重組克隆pMD-T/gapC經(jīng)測序后，與GenBank上已發(fā)表的序列進(jìn)行對比分析。然后，將gapC基因插入到pQE-30載體上，構(gòu)建重組質(zhì)粒pQE30/gapC。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coliM15(pREP4)，IPTG誘導(dǎo)后，SDS-PAGE鑒定GapC融合蛋白的表達(dá)。重

3、組蛋白經(jīng)純化后進(jìn)行GAPDH活性檢測和Western blot檢測，確定其GAPDH活性及特異性抗體結(jié)合活性。25只健康家兔隨機(jī)分成5組，分別用重組蛋白、全菌體滅活菌苗及對照劑(PBS)對其進(jìn)行免疫。應(yīng)用ELISA方法檢測血清中l(wèi)gG抗體水平及加強(qiáng)免疫第14d血清中IFN-γ、IL-4細(xì)胞因子濃度。最后，用S.aureus菌株Wood46對免疫兔攻毒，觀察攻毒后家兔的臨床癥狀、病理變化，對試驗(yàn)兔的肝、脾及腎臟進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定，確定其發(fā)病

4、情況，進(jìn)而評價(jià)GapC蛋白的免疫保護(hù)效果。 結(jié)果本研究成功擴(kuò)增并克隆了S.aureus BMSA/855/23-1株的gapC基因，該菌株的gapC基因與GenBank上S.aureus BM10株的核苷酸序列一致性為99.3％，推導(dǎo)氨基酸序列一致性為99.4％。SDS-PAGE結(jié)果表明，重組質(zhì)粒pQE30/gapC在E.coli M15(pREP4)中成功表達(dá)，GAPDH活性檢測及Western Blot檢測表明重組蛋白具有較

5、高的GAPDH活性和抗原性。GapC蛋白及全菌體組兔血清中抗IgG抗體水平在加強(qiáng)免疫后第28d達(dá)到最高(1：64000)。加強(qiáng)免疫后第14d血清中細(xì)胞因子IFN-γ和IL-4濃度與對照組相比，顯著升高(p<0.05)；而全菌體免疫組細(xì)胞因子濃度升高不明顯(p>0.05)。在加強(qiáng)免疫第10d，用5×10<'7>CFU/mL .S. aureus對家兔進(jìn)行攻毒，結(jié)果蛋白免疫組家兔中僅有1只家兔發(fā)病(1/5)。 以上結(jié)果表明，表達(dá)的重