產(chǎn)β-葡聚糖酶啤酒酵母工程菌株的構(gòu)建.pdf

1、在啤酒釀造過程中，β-葡聚糖會增加溶液粘度，給過濾帶來困難。目前啤酒工業(yè)生產(chǎn)中主要通過添加酶制劑來加以改善，因此增加了生產(chǎn)環(huán)節(jié)及成本。本研究是通過分子生物學(xué)及基因工程學(xué)構(gòu)建能夠產(chǎn)β-葡聚糖酶且其他性能不變的啤酒酵母工程菌株，為啤酒釀造節(jié)省生產(chǎn)成本及簡化生產(chǎn)步驟。主要研究內(nèi)容及結(jié)果如下。
　　1.篩選產(chǎn)β-葡聚糖酶的出發(fā)菌株
　　根據(jù)β-葡聚糖酶的特性，即對大麥β-葡聚糖有底物專一性，設(shè)計(jì)了初篩、復(fù)篩路線。確定了一株在較高溫度

2、下仍具有較高酶活的菌株為研究對象，通過對菌種的初步鑒定確定該菌為枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis，命名為Bacillus subtilis strain SK-1。
　　2.β-葡聚糖酶基因在啤酒酵母菌中的克隆與表達(dá)
　　從啤酒酵母基因組中PCR擴(kuò)增3-磷酸甘油酸激酶基因啟動(dòng)子PGK1、信息素α-因子分泌信號序列MPa2以及乙醇脫氫酶基因終止子的序列ADH4為調(diào)控元件，以大腸桿菌-酵母菌穿梭質(zhì)粒YEp352為載

3、體，構(gòu)建了以β-葡聚糖酶基因BGL3的酵母表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化酵母，通過篩選獲得了能夠表達(dá)且能夠有效分泌β-葡聚糖酶的重組酵母工程菌株。對該菌株分泌的β-葡聚糖酶的酶活性進(jìn)行初步測定，結(jié)果顯示，在培養(yǎng)60h時(shí)酶活最高。
　　3.β-葡聚糖酶的酶活性能測定
　　通過DNS法對出發(fā)菌株Bacillus subtilis strain SK-1以及重組酵母工程菌株產(chǎn)β-葡聚糖酶進(jìn)行酶活性能測定，并進(jìn)行了對比。結(jié)果顯示，其最適溫度都是50

4、℃，但重組酶的較高酶活在50~60℃范圍。同時(shí)其酶的熱穩(wěn)定性發(fā)生改變，重組酶與出發(fā)酶相比較，在50℃后殘留酶活迅速降低。與出發(fā)酶相比，重組酶的最適pH以及pH穩(wěn)定性都發(fā)生了改變，出發(fā)酶的最適pH以及pH穩(wěn)定性都在pH7.0左右。而重組酶最適pH以及pH穩(wěn)定性都在pH5.0~6.0。
　　4.發(fā)酵性能的測定
　　對構(gòu)建的啤酒酵母工程菌株的發(fā)酵性能進(jìn)行了測定，主要包括凝聚性、死滅溫度、外觀發(fā)酵度、真實(shí)發(fā)酵度、發(fā)酵速度、雙乙酰以及