雙功能β-葡聚糖酶-木聚糖酶與β-葡聚糖酶-植酸酶融合酶的優(yōu)化構(gòu)建及其酶學(xué)特性分析.pdf

1、β-葡聚糖酶(Glu)、木聚糖酶(Xyl)和植酸酶(Phy)是飼用復(fù)合酶制劑的常規(guī)組分,用于消除日糧中最重要的三種抗?fàn)I養(yǎng)因子--β-葡聚糖、木聚糖和植酸(鹽),以提高飼料營(yíng)養(yǎng)素的生物利用率。復(fù)合酶制劑一般是將分別生產(chǎn)的各種酶進(jìn)行混配生產(chǎn),通過(guò)基因工程技術(shù)生產(chǎn)雙(或多)功能酶將大大降低復(fù)合酶制劑的生產(chǎn)成本。因此,本研究以上述三種酶的基因?yàn)槌霭l(fā)點(diǎn),分別進(jìn)行了β-葡聚糖酶-木聚糖酶和β-葡聚糖酶-植酸酶兩兩間無(wú)連接肽的頭尾相連融合,繼而在對(duì)融

2、合酶和親本酶定性比較的基礎(chǔ)上進(jìn)行了連接肽的優(yōu)化篩選。通過(guò)在擬融合的兩個(gè)功能單位之間嵌入適當(dāng)?shù)亩嚯?獲得了兩個(gè)功能單位的催化特性均顯著提高的β-葡聚糖酶-木聚糖酶融合酶和成功表達(dá)雙功能活性的β-葡聚糖酶-植酸酶融合酶。主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果分述如下： β-葡聚糖酶-木聚糖酶和β-葡聚糖酶-植酸酶無(wú)連接肽融合酶構(gòu)建應(yīng)用基因重疊延伸技術(shù)(splicing-by-overlap extensiort,SOE),分別構(gòu)建了β-葡聚糖酶-木聚糖

3、酶和β-葡聚糖酶-植酸酶無(wú)連接肽融合酶的基因gx和gp,并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21,均獲得成功表達(dá)。融合酶gx表現(xiàn)出同時(shí)具有β-葡聚糖酶和木聚糖酶兩種酶活的雙功能。酶學(xué)特性分析表明,與親本酶相比,融合酶gx的Glu部分的催化效率(K_(cat)/K_(m)=6492)達(dá)到親本酶(K_(cat)/K_(m)=1563)的4.15倍,而Xyl部分的催化效率(K_(cat)/K_(m)=903)卻只有親本(K_(cat)/K_(m)=1311)的

4、69％。除Glu部分的熱穩(wěn)定性不如親本外,融合酶gx所有酶學(xué)特性(最適溫度、最適pH及耐酸堿的穩(wěn)定性)均類(lèi)似于親本。但是,融合酶gp檢測(cè)不出β-葡聚糖酶和植酸酶任一親本的活性。由此暗示,融合酶的功能單位間存在不一定不利的互作,通過(guò)適當(dāng)連接肽的嵌入,使兩單位間保持合適的距離,有可能獲得兩個(gè)功能單位效率均得到提高的β-葡聚糖酶-木聚糖酶融合酶。對(duì)融合酶gp而言,兩個(gè)功能單位的活性喪失,有可能與兩兩間的過(guò)分靠攏有關(guān),所以嵌入適當(dāng)連接肽也有可能

5、獲得同時(shí)具有β-葡聚糖酶和植酸酶活性的β-葡聚糖酶-植酸酶融合酶。 連接肽的優(yōu)化與β-葡聚糖酶-木聚糖酶融合酶基因的構(gòu)建以柔性肽[GGGGS]_n(n≤3)和具有α-螺旋的剛性肽[EAAAK]_n(n≤3)以及另兩條多肽為連接肽,構(gòu)建β-葡聚糖酶-木聚糖酶融合酶基因,其中編碼(GGGGS)_3的五個(gè)堿基序列包括S3、S3-1、S3-2、S3-3和S3-4。應(yīng)用SOE技術(shù)構(gòu)建融合酶基因12個(gè),獲得了表現(xiàn)雙功能活性的8個(gè)融合蛋白GI

6、u-S3-Xyl、Glu-S2-Xyl、Glu-Sl-Xyl、Glu-S-Xyl、Glu-H-Xyl、Glu-α3-Xyl、Glu-α2-Xyl和Glu-αl-Xyl,但連接肽S3-1、S3-2、S3-3和S3-4對(duì)應(yīng)的融合酶基因未能在BL21中正常表達(dá)。上述結(jié)果顯示,富含GC的(GGGGS)3堿基編碼序列區(qū)域可能會(huì)因?yàn)樾纬煞€(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)而導(dǎo)致融合基因的翻譯效率降低。此外,由mRNA翻譯過(guò)程中核糖體A和P位上相鄰兩個(gè)氨酰-tRNA同工受

7、體的兼容性引起密碼子對(duì)的偏愛(ài)性,也可能直接影響mRNA的解碼速度和準(zhǔn)確性。因此,在連接肽的氨基酸殘基序列組成確定的情況下,其堿基編碼序列的設(shè)計(jì)也須給予足夠重視。連接肽對(duì)雙功能β-葡聚糖酶-木聚糖酶融合酶的影響通過(guò)硫酸銨分級(jí)沉淀、緩沖液(pH 5.0)沉淀及陽(yáng)離子交換等步驟,分別純化了8個(gè)具有雙功能的β-葡聚糖酶-木聚糖酶融合酶,并對(duì)其進(jìn)行了雙功能酶學(xué)特性分析。與親本相比,所有融合酶Glu部分的催化效率(Kcat/Km：4748-6658

8、)均優(yōu)于親本(Kcat/Km=1563),分別達(dá)到親本的3.0-4.3倍；而融合酶Xyl部分的催化效率(Kcat/Km=1073-1875)達(dá)到親本的82％-143％,均高于無(wú)連接肽的gx對(duì)應(yīng)部分(Kcat/Km=903)。連接肽S2的融合效果最佳,融合酶Glu-S2-Xyl的Glu和Xyl部分的催化效率分別比親本提高了326％和43％；其次是α3作為連接肽的融合酶Glu-α3-Xyl,其Glu和Xyl的催化效率分別高于親本262％和3

9、1％。結(jié)果表明,通過(guò)嵌入適當(dāng)?shù)倪B接肽,使融合酶的兩個(gè)功能單位形成有益的互作,可以達(dá)到雙功能催化效率都優(yōu)于親本的效果。不同結(jié)構(gòu)類(lèi)型的柔性肽(如S2)和具有α-螺旋結(jié)構(gòu)的剛性肽(如α3)都有可能實(shí)現(xiàn)雙優(yōu)的結(jié)果。結(jié)構(gòu)類(lèi)型相同的連接肽的長(zhǎng)度也在一定程度上影響融合酶兩個(gè)功能單位的催化效率。因此,連接肽的篩選對(duì)于融合蛋白的構(gòu)建是完全必要的。 β-葡聚糖酶-植酸酶融合酶基因的優(yōu)化構(gòu)建以柔性肽(GGGGS)2、(GGGGS)3和α-螺旋剛性肽(

10、EAAAK)1及(EAAAK)2為連接肽,構(gòu)建4個(gè)β-葡聚糖酶-植酸酶融合酶基因,并分別在BL21中成功表達(dá)4個(gè)β-葡聚糖酶-植酸酶融合酶蛋白Glu-S2-Phy、Glu-pS3-Phy、Glu-αl-Vhy及Glu-α2-Phy。其中,后三者表現(xiàn)出雙功能活性,而Glu-S2-Phy僅具有β-葡聚糖酶活性。根據(jù)所用連接肽的氨基酸殘基數(shù),本研究中柔性和剛性?xún)深?lèi)連接肽在β-葡聚糖酶-植酸酶融合酶中的折疊類(lèi)型必然有所不同。結(jié)合連接肽S2對(duì)應(yīng)融

11、合酶GIu-S2-Xyl的雙功能催化效率最佳的事實(shí),證明連接肽的選擇與需融合的兩親本酶結(jié)構(gòu)及大小之間存在關(guān)聯(lián)。 綜上所述,本研究的主要結(jié)果,一是通過(guò)連接肽的優(yōu)化篩選而獲得了三個(gè)Glu及Xyl部分催化效率均大幅或顯著提高的雙功能β-葡聚糖酶-木聚糖酶融合酶,說(shuō)明篩選出的連接肽使融合酶的兩個(gè)功能單位形成了合理的有利互作。二是獲得了三個(gè)具有雙功能的β-葡聚糖酶-植酸酶融合酶,并由此證明連接肽的選擇與所需融合的兩個(gè)功能蛋白的結(jié)構(gòu)和大小相