高產纖維素酶菌株的篩選、鑒定及內切葡聚糖酶高表達基因工程菌的構建.pdf

1、纖維素在地球上分布廣泛，隨處可見，我國地大物博，資源豐富，纖維素資源也是極其豐富，但是，由于其結構穩(wěn)定、不易水解等特點，大大限制了其利用范圍。如果可以利用大量微生物，讓它們產生降解纖維素的酶，通過酶將纖維素分解轉化，不僅可以解決環(huán)境污染的問題，而且可以合理利用纖維素資源。此外，纖維素資源的合理利用，對開發(fā)飼料資源，生產農業(yè)能源，發(fā)展畜牧業(yè)資源，減輕人類對環(huán)境的污染都具有重大的意義。
　　雖然人們在纖維素酶的篩選方面，做了大量研究工

2、作，并且也獲得了一定的成果，但是截止到現在，產酶能力高的菌株由于其自身的諸多局限，沒有被很好的利用。隨著生物技術的發(fā)展，有關β-內切葡聚糖酶基因的克隆和表達的研究越來越深入，但是，由于各種條件如耐熱性差，穩(wěn)定性差等的限制，真正轉化為生產實踐的基因工程菌少之又少。因此，利用合理的方法構建高表達β-內切葡聚糖酶基因工程菌并應用于生產實踐，將大大加快纖維質原料在工農業(yè)生產的利用步伐。
　　1.本實驗采用剛果紅染色法(Congo red

3、staining)，選擇灌木叢、腐木、稻桿堆積等纖維素含量豐富的土壤中取樣，通過羧甲基纖維素鈉固體培養(yǎng)基富集后分離單菌落，以剛果紅染色法(Congo red staining)進行復篩，篩出6株水解圈大，CMC酶活力高的菌株，編號后，對它們進行16S rDNA及生理生化的鑒定，結果發(fā)現，2號為蠟狀芽孢桿菌（Waxy bacillus），5號為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，9號為巨大芽孢桿菌(Huge bacillus

4、)，10號為地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)，11號為微小桿菌（Tiny bacteria），12號為綠色木霉（Greentrichoderma viride）。利用候選菌株對兩種不同的纖維質材料麩皮和米糠進行固態(tài)發(fā)酵，DNS法測量了OD值，計算出發(fā)酵后的酶活力，結果顯示，地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)發(fā)酵后的酶活力最強，麩皮和米糠作為底物發(fā)酵后酶活值分別達到3437U/ml和85

5、41U/ml，為工農業(yè)生產及畜牧業(yè)帶來了巨大的的應用前景和經濟效益。
　　2.在上述候選菌株中，本研究選擇酶活力最大的10號菌株地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)作為研究對象，對其生長條件包括發(fā)酵溫度、時間及含水量進行優(yōu)化，結果發(fā)現:當培養(yǎng)溫度為30℃，培養(yǎng)時間達到60 h，初始水分含量為40％時，其產酶能力達到最大。為進一步利用此菌株進行工業(yè)化生產和飼料研究奠定了理論基礎，也為以后的應用指明了方向。

6、r>　　3.依據已公布的纖維素內切葡聚糖酶基因(www.ncbi.nlm.nih.gov)，設計特異性引物，進行PCR擴增獲得一長度為732bp的特異產物，測序后發(fā)現該基因序列與公布的纖維素酶基因片段同源性達99％，表明成功克隆到該基因。
　　4.在上述獲得的纖維素酶基因兩端引入ECOR1和HandⅢ酶切位點，重新設計引物獲得PCR產物后，將該纖維素酶基因連接到PET-28a載體上，并轉化到大腸桿菌，獲得基因工程菌。酶切后進行聚丙