β-1，3-1，4-葡聚糖酶重組畢赤酵母的構建及其產(chǎn)酶發(fā)酵工藝優(yōu)化.pdf

1、β-1，3-1，4-葡聚糖酶(EC3.2.1.73)作為一種重要的工業(yè)用酶，被廣泛應用于釀酒和飼料工業(yè)中。目前國內對葡聚糖酶的研究還處于初級階段，天然菌株產(chǎn)酶量及酶性能滿足不了實際應用。隨著基因工程方法的應用，為實現(xiàn)目的蛋白的工程菌表達提供的了可能。現(xiàn)國內外對β-1，3-1，4-葡聚糖酶的研究集中在構建工程菌株來提高酶的產(chǎn)量和性能方面。本研究的主要目的即通過基因工程及分子生物學方法來提高β-1，3-1，4-葡聚糖酶表達量，研究其酶學特性

2、，為生產(chǎn)中的問題提供有效的解決途徑。主要研究內容及結果如下： ⑴采用PCR法從載體pLF3中擴增出雜合β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因，并在基因兩端引入酶切位點EcoR I/Not I，插入帶有AOX啟動子和α-信號肽的表達載體pPIC9K的多克隆位點，構建出重組載體pPIC9K-bgl；經(jīng)Sac I線性化重組載體后，通過電轉化將其導入Pichia pastoris GS115，使基因整合到酵母染色體上；最終篩選出甲醇利用型Hi

3、s+Mut+，其最高抗遺傳霉素濃度為2 mg mL-1約有7-8個拷貝數(shù)的重組GS115/pPIC9K-bgl。甲醇誘導重組菌表達β-1，3-1，4-葡聚糖酶，對誘導的條件進行優(yōu)化，確定誘導表達最佳條件為pH6.0，最適溫度30℃，表達時間84 h。 ⑵利用3L發(fā)酵罐進行重組畢赤酵母發(fā)酵優(yōu)化。先以甘油為碳源，在甘油補加階段，細胞干重達47.5 g L-1；甲醇誘導階段，流加甲醇控制溶氧維持在35％，誘導84 h后酶活達到最高值1

4、15.3 U mL-1，蛋白表達量131.8 mg L-1，細胞干重88.5 g L-1。并通過SDS-PAGE對重組蛋白進行分析，得出分子量約為34 kDa，由于糖基化作用，比理論分子量大了約8 kDa，目的蛋白占胞外總蛋白約75％。 ⑶確定了β-1，3-1，4-葡聚糖酶的酶學性質。該酶在pH4.5-7.0之間相對穩(wěn)定，在pH6.0時酶活力達到最高，而在pH3.5-8.0間保溫60 min，酶活仍然有80％以上；最適反應溫度5