小鼠體節(jié)期胚胎-定向造血的發(fā)育動力學研究.pdf

1、胚胎造血發(fā)育一直是造血干細胞(hematopoietic stem cells，HSC)生物學的研究熱點，分為原始和定向造血兩個階段。后者以淋巴細胞和HSC的產(chǎn)生為標志。近三十年來，對淋巴系統(tǒng)和HSC的起源認識由胚外的卵黃囊逐漸轉(zhuǎn)移到胚內(nèi)的主動脈-性腺-中腎區(qū)(aorta-gonad-mesonephros region，AGM region，AGM區(qū))。Cumano等發(fā)現(xiàn)：胚胎循環(huán)建立前，胚內(nèi)的臟壁層而非胚外的卵黃囊可通過與基質(zhì)細胞和

2、胸腺組織塊共培養(yǎng)在體外產(chǎn)生B和T淋巴細胞。然而，該結(jié)論并未在其它實驗室和通過其它培養(yǎng)體系得以驗證。與淋系的體外分化系統(tǒng)相比，通過移植和連續(xù)移植長期重建(4-6個月)致死劑量照射的成體小鼠的造血系統(tǒng)是鑒定HSC的金標準。主流觀點認為小鼠E10.5的AGM區(qū)是最早自主產(chǎn)生HSC的位點。近期，研究者發(fā)現(xiàn)HSC在胚外的胎盤組織出現(xiàn)的時間與AGM區(qū)幾乎相當，且在數(shù)量上顯著多于AGM區(qū)，提示HSC的發(fā)生是多位點的。既往研究發(fā)現(xiàn)：小鼠E9胚胎的頭部含

3、有典型的造血祖細胞，同時還表達SCL/Tal、GATA1等造血標志。但是，該部位是否具有定向造血的潛能尚屬未知。
　　 本研究的第一部分，為明確能自主產(chǎn)生淋系的解剖部位，我們選取小鼠E8.5胚胎(1-7體節(jié))的卵黃囊(胚外)和臟壁層(胚內(nèi))作為實驗對象，此時血液循環(huán)尚未建立。在標準的集落形成實驗中，兩者均能產(chǎn)生典型的造血集落，但類型有差異。通過OP9共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)：臟壁層可產(chǎn)生B淋巴細胞，它們表達B220、CD19和IgM。采用三步

4、法在OP9-DL1上誘導臟壁層至第16天，可產(chǎn)生CD44-/CD25+幼稚T細胞前體以及CD4+/CD8-單陽性T細胞。然而，上述共培養(yǎng)體系均不能誘導卵黃囊產(chǎn)生B和T淋巴細胞。我們的研究表明：與卵黃囊相比，臟壁層具有較強的體外淋系分化潛能。
　　 本研究的第二部分，我們從髓系祖細胞、淋巴細胞、HSC三個方面比較了胚胎AGM區(qū)和頭部的造血特點。首先，分離E9.5-E12.5小鼠胚胎的尾部(caudalhalf，簡稱CH，該位點在E

5、10.5發(fā)育成AGM區(qū))/AGM區(qū)和頭部，利用Ⅰ型膠原酶消化成單細胞，按照一定的胚胎當量(embryo equivalents，ee)接種于造血集落培養(yǎng)體系(含有SCF、IL-3、IL-6、Epo等造血因子)。第4天觀察發(fā)現(xiàn)CH/AGM區(qū)和頭部均產(chǎn)生了CFU-E，第7天出現(xiàn)CFU-GM，繼而出現(xiàn)CFU-Mix。我們發(fā)現(xiàn)E9.5小鼠頭部細胞產(chǎn)生的造血集落多為紅系且致密，而CFU-GM較少。E10.5之后，CFU-GM明顯增多。AGM區(qū)的粒

6、單系集落形態(tài)均一，呈圓形或者橢圓形，而頭部的粒單系集落較大，細胞較分散，形狀不規(guī)則。此外，我們還研究了CH/AGM區(qū)和頭部的髓系造血祖細胞(即CFU-C)的發(fā)育動力學，發(fā)現(xiàn)4個時間點(E9.5-E12.5)的CH/AGM區(qū)的CFU-C的數(shù)量變化不大。相反，與E10.5相比，E11.5頭部的CFU-C數(shù)量顯著增加達到高峰，之后又逐漸減少。利用磁珠分選，發(fā)現(xiàn)AGM區(qū)和頭部的CFU-C集中于Tie2+細胞群。上述結(jié)果表明：小鼠胚胎AGM區(qū)和頭

7、部均存在髓系造血祖細胞，但兩者在祖細胞的類型和發(fā)育動力學等方面存在差異。
　　 之后，我們考察了CH/AGM區(qū)和頭部的淋系發(fā)育潛能。我們利用OP9基質(zhì)細胞共培養(yǎng)體系考察B細胞的分化潛能。在SCF、FL、IL-7等細胞因子的作用下，第3-4天時OP9上有細胞簇出現(xiàn)，隨后出現(xiàn)顯著的半貼壁細胞擴增，其形態(tài)類似淋巴細胞。第7-10天收集上述細胞進行流式細胞分析發(fā)現(xiàn)(代表性數(shù)據(jù))：CH誘導獲得的細胞表達B220(23.0％)、CD19(2

8、5.0％)；頭部細胞的B220、CD19的陽性率分別為：36.7％和25.8％。上述結(jié)果表明E9.5小鼠的CH和頭部細胞均具有B細胞潛能。同樣，分離E9.5小鼠胚胎的CH和頭部，利用磁珠分選獲得Tie2+細胞，接種于OP9-DL1細胞上，在SCF、FL、IL-7等細胞因子作用下，發(fā)現(xiàn)OP9-DL1上有大量淋巴細胞樣細胞增殖。在連續(xù)的4個時間點檢測發(fā)現(xiàn)：隨著體外誘導時間的延長(7天、13天、19天、26天)，幼稚的T細胞前體(CD44-/

9、CD25+，DN3)、較成熟的雙陽性細胞(CD4+/CD8+)以及CD3+/TCRβ+的比例均逐漸增加。至第26天時(代表性數(shù)據(jù))，頭部與CH的變化趨勢基本一致，上述3種細胞亞群的比例分別達到20.1％、7.5％、8.2％。上述結(jié)果表明：在相同的誘導條件下，小鼠E9.5的CH和頭部細胞均能夠分化為T淋巴細胞，說明兩個位點均具有T淋巴細胞潛能。
　　 最后，我們考察了AGM區(qū)和頭部的HSC潛能。分離E12.5GFP轉(zhuǎn)基因小鼠胚胎的

10、AGM區(qū)和頭部，消化成單細胞后通過尾靜脈進行移植。移植后5個月，采集受體外周血進行流式細胞分析發(fā)現(xiàn)：AGM區(qū)(n=11)和頭部(n=21)的重建比例相近(45％Vs62％)，嵌合率亦相似(49.±19.0％Vs50.±22.1％)。上述數(shù)據(jù)表明：E12.5的AGM區(qū)和頭部含有的細胞均具有長期重建致死劑量照射小鼠造血系統(tǒng)的能力。利用磁珠分選后移植發(fā)現(xiàn)，AGM區(qū)和頭部的Tie2+細胞均能重建致死劑量照射受體。這些結(jié)果表明，具有體內(nèi)造血活性的

11、頭部細胞表達Tie2，與同期的其它造血組織類似。為檢測E12.5小鼠胚胎AGM區(qū)和頭部細胞移植后的多系嵌合潛能，我們對受體外周血進行了髓系(Mac-1，Gr-1)和淋系(B220，CD3)嵌合率的檢測，發(fā)現(xiàn)：無論是AGM區(qū)還是頭部細胞移植后的陽性受體，其外周血都有相當比例的供體來源的髓系和淋系嵌合。此外，我們對部分重建受體的骨髓、脾臟、胸腺進行了檢測，發(fā)現(xiàn)AGM區(qū)和頭部來源的造血細胞均能在這些成體造血組織高比例嵌合，說明E12.5小鼠胚