WIP1對(duì)小鼠胚胎造血發(fā)育調(diào)控的異質(zhì)性研究.pdf

1、造血干細(xì)胞（hematopoietic stem cell,HSC）發(fā)育調(diào)控是近年來(lái)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)、再生醫(yī)學(xué)、干細(xì)胞生物學(xué)和免疫學(xué)等多學(xué)科交叉研究的重點(diǎn)。造血干細(xì)胞移植可以給很多惡性血液病、淋巴瘤等其他某些實(shí)體腫瘤患者帶來(lái)很好的療效。造血干細(xì)胞來(lái)源有限且無(wú)法在體外大量有效擴(kuò)增是限制其臨床應(yīng)用的主要瓶頸。深入探究造血干細(xì)胞發(fā)育規(guī)律將有助于體外誘導(dǎo)擴(kuò)增可供使用的造血干細(xì)胞。然而，由于造血干細(xì)胞的發(fā)育涉及多個(gè)組織多個(gè)精密的分化階段，對(duì)其中的相關(guān)機(jī)

2、理探討頗具科學(xué)意義。
　　造血干細(xì)胞可以在受體內(nèi)長(zhǎng)期多譜系重建受損的造血系統(tǒng)。然而越來(lái)越多的研究表明每個(gè)造血干細(xì)胞都有各自不同的特征，具有異質(zhì)性，這些不同體現(xiàn)在分化的譜系偏向、細(xì)胞增殖能力、細(xì)胞周期、自我更新能力的強(qiáng)弱、對(duì)信號(hào)調(diào)控的反應(yīng)等多個(gè)方面。
　　Wild-type（WT）p53-induced phosphatase1（WIP1）是由Ppm1d基因編碼的絲氨酸、蘇氨酸磷酸酶，與PP2C磷酸酶家族成員具有高度的同源性。

3、WIP1廣泛分布于成體和胚胎組織，它具有多種生理功能，參與調(diào)控胸腺的穩(wěn)態(tài)維持，參與早期T、B細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的發(fā)育和成熟。WIP1在成體HSC中高表達(dá)，調(diào)控成體HSC的穩(wěn)態(tài)維持和分化。Wip1敲除小鼠（Wip1-/-，KO）的骨髓、外周血、脾臟的B淋巴細(xì)胞數(shù)目較野生型（Wip1+/+，WT）明顯減少，B細(xì)胞內(nèi)p53持續(xù)激活，導(dǎo)致凋亡水平上調(diào)。Wip1-/-小鼠成體骨髓 HSC表現(xiàn)衰老的表型，包括造血干細(xì)胞池?cái)U(kuò)大，造血重建活力減低，而刪除

4、 p53可以挽救多系重建缺陷，但是不影響造血干細(xì)胞池的擴(kuò)大，后者被證明與mTORC1介導(dǎo)的HSC增殖相關(guān)。然而，WIP1是否調(diào)控胚胎期造血干細(xì)胞的發(fā)育及其調(diào)控特點(diǎn)仍未知。本課題旨在利用Wip1基因敲除小鼠對(duì)WIP1在胚胎造血發(fā)育中的作用及其調(diào)控規(guī)律進(jìn)行研究。
　　首先，我們對(duì)Wip1缺失對(duì)胚胎期不同造血位點(diǎn) HSC發(fā)育的影響進(jìn)行研究，包括胎肝、AGM區(qū)、卵黃囊、胎盤(pán)、頭部的 HSC的數(shù)目和功能。前期研究中發(fā)現(xiàn)，Wip1缺失小鼠胚胎

5、大體外觀較野生型小，胎肝發(fā)育體積較野生型小，Wip1缺失胎肝造血干細(xì)胞發(fā)育異常，表型HSC數(shù)目下降，HSC體內(nèi)移植功能下降。AGM區(qū)作為HSC產(chǎn)生和成熟的重要位點(diǎn)，我們通過(guò)直接移植實(shí)驗(yàn)證明Wip1缺失胚胎AGM區(qū)幾乎沒(méi)有正常功能型的HSC。Wip1缺失卵黃囊、胎盤(pán)和頭部直接移植，發(fā)現(xiàn)均有重建，但是較野生型比HSC的數(shù)目和功能有不同程度的受損，受損程度介乎胎肝和AGM區(qū)之間。因既往研究表明WIP1與增殖、細(xì)胞周期、凋亡相關(guān)，于是我們考察了

6、Wip1-/-E12.5胎肝HSC的增殖、細(xì)胞周期和凋亡。取Wip1+/+和Wip1-/-E12.5胎肝的細(xì)胞，分別標(biāo)記HSC的同時(shí)標(biāo)記CD168考察增殖，標(biāo)記Ki67/7-AAD考察周期，標(biāo)記AnnexinV/7-AAD考察凋亡。和Wip1+/+相比，Wip1-/-HSC在增殖和周期上表現(xiàn)更活躍，凋亡有所增多。
　　接下來(lái)我們考察Wip1缺失對(duì)小鼠胚胎AGM區(qū)pre-HSC的產(chǎn)生及功能的調(diào)控作用，主要分為體外體內(nèi)兩部分。體外主要

7、是考察pre-HSC與基質(zhì)細(xì)胞OP9-DL1共孵育移植過(guò)程中應(yīng)用WIP1抑制劑CCT的影響。我們想先排除WIP1抑制劑對(duì)基質(zhì)細(xì)胞的抑制作用，分別用DMSO（作對(duì)照）和CCT作用基質(zhì)細(xì)胞OP9-DL148小時(shí)，考察OP9-DL1表面干性標(biāo)志和其他造血相關(guān)標(biāo)志包括Sca-1、CD44、CD31、CD45的變化情況，同時(shí)檢測(cè)其增殖、凋亡，以上均未發(fā)現(xiàn)明顯差異，說(shuō)明WIP1抑制劑對(duì)基質(zhì)細(xì)胞的功能狀態(tài)無(wú)抑制?？疾霿IP1抑制劑CCT對(duì)單個(gè)pre-

8、HSC體外孵育增殖的影響。流式分選E11.5 WT小鼠胚胎AGM單個(gè)的T1 pre-HSC（CD31+CD41lowCD45-c-Kit+CD201high）和T2pre-HSC（CD31+CD45+c-Kit+201high）體外孵育6天，實(shí)驗(yàn)組加CCT，對(duì)照組加DMSO，計(jì)數(shù)形成大、中、小型簇的數(shù)目。結(jié)果顯示，無(wú)論對(duì)于T1 pre-HSC還是T2 pre-HSC，與對(duì)照組比CCT在體外均能明顯抑制大型簇的形成，總體上對(duì)于T1 pre

9、-HSC抑制更為明顯，形成的小型簇比例更多。隨后考察WIP1抑制劑CCT對(duì)T1 pre-HSC、T2 pre-HSC孵育移植的功能影響。我們分選出野生型(或CD45.1/CD45.2)胚胎的E11 AGM區(qū)包括T1 pre-HSC（CD31+CD41+CD45-）和T2 pre-HSC（CD31+CD45+）的群體在體外孵育，孵育過(guò)程中用CCT處理（對(duì)照組用DMSO），孵育6天后移植，移植后1-4個(gè)月檢測(cè)受體外周血嵌合率。具體移植重建結(jié)

10、果：T1 pre-HSC對(duì)照組重建為6/7，實(shí)驗(yàn)組為0/7；T2 pre-HSC對(duì)照組為7/7，實(shí)驗(yàn)組為3/6。結(jié)果表明，CCT會(huì)嚴(yán)重抑制T1 pre-HSC、T2 pre-HSC的體外孵育成熟，而對(duì)T1 pre-HSC較T2 pre-HSC的抑制更為明顯。
　　隨后將Wip1-/-小鼠胚胎AGM區(qū)T1 pre-HSC、T2 pre-HSC孵育移植。我們將Wip1+/-與Wip1+/-小鼠交配，獲得WT、HT、KO三種基因型的胚胎

11、，分離E11 AGM區(qū)，流式分選包括T1 pre-HSC和T2 pre-HSC群體體外與OP9-DL1共培養(yǎng)6天后移植，采集外周血檢測(cè)重建情況。通過(guò)移植后1-6個(gè)月外周血的數(shù)據(jù)采集，我們發(fā)現(xiàn)Wip1-/-胚胎T1 pre-HSC孵育移植可以檢測(cè)到重建，且重建比例和嵌合率與野生型相近，說(shuō)明T1 pre-HSC體外可以發(fā)育為功能基本正常的造血干細(xì)胞；而T2 pre-HSC的孵育移植外周血嵌合率較野生型明顯下降。上述結(jié)果表明，生理?xiàng)l件下，Wi

12、p1缺失胚胎AGM區(qū)可以產(chǎn)生功能較正常的T1 pre-HSC，體外孵育可以獲得功能正常的HSC，但是WIP1體內(nèi)持續(xù)缺失一旦形成T2 pre-HSC，孵育移植則有明顯的功能缺陷。
　　為了更充分的比較Wip1缺失與否對(duì)胚胎期的各位點(diǎn)的造血發(fā)育產(chǎn)生的影響，我們將目光放在了循環(huán)血上，而循環(huán)血中是否存在pre-HSC仍是未解之謎。于是我們對(duì)野生型小鼠E10(31-40sp)、E11(41-44sp)胚胎循環(huán)血細(xì)胞進(jìn)行類(lèi)似AGM區(qū)pre-

13、HSC的分析和分選孵育移植實(shí)驗(yàn)，分別進(jìn)行了4次、7次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，分別檢測(cè)了25只、80只受體，結(jié)果均未檢測(cè)到重建。在現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，未能從功能移植實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到循環(huán)血pre-HSC。
　　綜合以上數(shù)據(jù)，我們的工作揭示了WIP1在小鼠胚胎重要的造血發(fā)育位點(diǎn)包括胎肝、AGM區(qū)、卵黃囊、胎盤(pán)、頭部對(duì)造血干細(xì)胞發(fā)育調(diào)控都發(fā)揮著不同程度的重要作用，其中對(duì)AGM區(qū)HSC的形成及功能至關(guān)重要，對(duì)胎肝和卵黃囊、胎盤(pán)、頭部影響較AGM不同程度減弱。我們

14、首次發(fā)現(xiàn)WIP1對(duì)造血干細(xì)胞前體的調(diào)控作用，尤其是對(duì)T1 pre-HSC和T2 pre-HSC具有差異性調(diào)控作用，WIP1缺失不影響T1 pre-HSC形成及功能，但是WIP1持續(xù)缺失對(duì)于T1 pre-HSC的進(jìn)一步成熟為HSC具有嚴(yán)重抑制作用。WIP1抑制劑CCT會(huì)嚴(yán)重抑制T1 pre-HSC、T2 pre-HSC的體外孵育成熟，而對(duì)T1 pre-HSC較T2 pre-HSC的抑制更為明顯。關(guān)于WIP1對(duì)造血干細(xì)胞發(fā)育調(diào)控的相關(guān)研究使