1,2：3,4-二環(huán)氧丁烷誘導(dǎo)細(xì)胞DNA雙鏈斷裂損傷及其修復(fù)機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：
　　1，3-丁二烯(1，3-butadiene，BD)是一種重要的工業(yè)原料，用于合成橡膠、塑料等石油化工和制造行業(yè)。美國(guó)將BD列為前40位重要的化學(xué)品之一，應(yīng)用范圍廣，職業(yè)接觸人群多。此外，汽車尾氣、香煙煙霧及食用油油煙中也發(fā)現(xiàn)BD普遍存在，屬于室內(nèi)具有慢性空氣危害的9種優(yōu)先污染物之一。因此BD不僅是一種職業(yè)暴露污染物，更是一種重要的環(huán)境空氣污染物，其危害范圍已從職業(yè)工人擴(kuò)展到普通人群。
　　BD可以誘導(dǎo)嚙齒動(dòng)物

2、多器官腫瘤的形成，人群研究也顯示出白血病發(fā)病相關(guān)的陽(yáng)性結(jié)果，因而被IARC和EPA列為確定的人類致癌物（1組）。BD的致癌效應(yīng)主要來(lái)自于體內(nèi)代謝產(chǎn)生的環(huán)氧化產(chǎn)物:1，2-環(huán)氧-3-丁烯(EB)，1，2-二羥基-3，4-環(huán)氧丁烯(EBD)和1，2:3，4-二環(huán)氧丁烯(DEB)。上述環(huán)氧化產(chǎn)物均能與DNA形成加合物，造成遺傳物質(zhì)的損傷，其中DEB的活性最強(qiáng)，因而目前對(duì)BD致癌機(jī)制研究多聚焦于闡明其遺傳損傷效應(yīng)。
　　既往研究發(fā)現(xiàn)BD及

3、其代謝物可以誘導(dǎo)DNA雙鏈斷裂和染色體損傷，但是BD誘導(dǎo)DNA雙鏈斷裂損傷后的修復(fù)機(jī)制并不清楚。本課題組前期在人群研究中發(fā)現(xiàn)BD暴露與核質(zhì)橋(NPB)比例升高相關(guān)。NPB是染色體損傷的標(biāo)志和細(xì)胞癌變的重要環(huán)節(jié)，研究BD誘導(dǎo)NPB形成的機(jī)制，將為闡明BD的致癌作用過(guò)程，預(yù)防和減少BD所誘導(dǎo)的染色體損傷和人群腫瘤的發(fā)生提供重要依據(jù)。有研究提示，NPB的形成可能與DNA雙鏈斷裂后，經(jīng)非同源末端連接(NHEJ)等錯(cuò)誤修復(fù)形成雙著絲粒染色體，在細(xì)

4、胞分裂后期分別牽引到兩個(gè)子細(xì)胞核有關(guān)。由此我們推測(cè)，BD及其代謝物誘導(dǎo)DNA雙鏈斷裂后，可能通過(guò)影響主要的DNA雙鏈斷裂修復(fù)通路，即HR和NHEJ修復(fù)通路，造成錯(cuò)誤修復(fù)效率的提高，從而引起NPB形成。因此，本課題以BD活性代謝物DEB為對(duì)象，在明確其誘導(dǎo)人淋巴母細(xì)胞DNA雙鏈斷裂和染色體損傷的條件下，研究DEB對(duì)DNA雙鏈斷裂修復(fù)通路的影響，進(jìn)一步驗(yàn)證修復(fù)通路在DEB致NPB形成中的作用，為深入探討B(tài)D的遺傳損傷機(jī)制提供依據(jù)。
　

5、　研究?jī)?nèi)容：
　　1.DEB的細(xì)胞毒性效應(yīng)研究
　　建立DEB染毒處理的人淋巴母細(xì)胞TK6細(xì)胞模型模型。分別采用MTS和EdU方法檢測(cè)DEB對(duì)細(xì)胞活性和增殖能力的影響。采用流式細(xì)胞儀分析技術(shù)，分別以PI和AnnixⅤ-FITC/PI染色檢測(cè)DEB對(duì)細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的影響。
　　2.DEB誘導(dǎo)細(xì)胞遺傳損傷的檢測(cè)
　　采用胞質(zhì)分裂阻滯微核試驗(yàn)(CBMNT)分析DEB對(duì)細(xì)胞染色體的損傷（微核率、核質(zhì)橋率、核芽突率及核

6、分裂指數(shù)）;采用Western blot和免疫熒光技術(shù)，檢測(cè)DNA雙鏈斷裂標(biāo)志物(γ-H2AX)的表達(dá)情況。
　　3.DEB對(duì)細(xì)胞DNA雙鏈斷裂損傷修復(fù)的影響
　　采用含有HR修復(fù)效率檢測(cè)報(bào)告底物的MCF-7細(xì)胞，檢測(cè)DEB處理后HR修復(fù)效率的變化。采用Cell-free方法，提取細(xì)胞總蛋白，與32p標(biāo)記的線性質(zhì)粒共同作用，檢測(cè)DEB處理后NHEJ修復(fù)效率的變化。采用Western blot、Slot blot或免疫熒光方法

7、檢測(cè)DNA損傷修復(fù)通路關(guān)鍵分子ATM、p-ATM、γ-H2AX、Ku80、DKA-PKcs、XLF、DNA-ligaseⅣ和BRCA1的表達(dá)，以觀察DEB對(duì)DNA雙鏈斷裂修復(fù)通路分子表達(dá)的影響。
　　4.NHEJ通路基因在DEB所致染色體損傷中的作用研究
　　采用化學(xué)抑制劑Nu7026處理細(xì)胞以抑制DNA-PKcs的表達(dá)，采用ShRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞以抑制Ku80的表達(dá)，通過(guò)CBMNT檢測(cè)細(xì)胞染色體損傷的變化，分析NHEJ通路在D

8、EB所致DNA雙鏈斷裂損傷修復(fù)及NPB形成中的作用。
　　研究結(jié)果：
　　1.DEB誘導(dǎo)TK6細(xì)胞增殖抑制、周期阻滯和細(xì)胞凋亡
　　DEB可以抑制TK6細(xì)胞的活力，降低DNA的合成，具有劑量效應(yīng)關(guān)系。進(jìn)一步通過(guò)流式細(xì)胞儀分析發(fā)現(xiàn)，DEB可以抑制TK6細(xì)胞的周期進(jìn)展，使細(xì)胞分裂阻滯在G2/M期。同時(shí)，DEB處理可誘導(dǎo)TK6細(xì)胞凋亡，2.5～10μM DEB處理后48h，細(xì)胞凋亡率均出現(xiàn)顯著升高(P＜0.01或0.001)

9、。
　　2.DEB誘導(dǎo)TK6細(xì)胞的染色體損傷及DNA雙鏈斷裂
　　CBMNT檢測(cè)結(jié)果表明，DEB可誘導(dǎo)TK6細(xì)胞的微核率、核質(zhì)橋率及核芽突率升高，造成細(xì)胞的染色體損傷，同時(shí)引起核分裂指數(shù)降低，抑制細(xì)胞增殖。此外，WesternBlot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，10μM DEB處理細(xì)胞后，DNA雙鏈斷裂標(biāo)志物γ-H2AX蛋白的表達(dá)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，先升高后降低，總體維持在一個(gè)高表達(dá)的水平。免疫熒光檢測(cè)也證實(shí)，10μM DEB處理可誘導(dǎo)細(xì)胞γ-H

10、2AX的大量表達(dá)。上述結(jié)果提示，DEB可造成TK6細(xì)胞的DNA雙鏈斷裂及染色體損傷。
　　3.DEB影響HR和NHEJ修復(fù)效率及相關(guān)基因的表達(dá)
　　采用含有pDR-GFP底物的細(xì)胞檢測(cè)DEB對(duì)HR修復(fù)效率的影響，結(jié)果顯示，DEB處理24 h后反映HR修復(fù)的熒光陽(yáng)性細(xì)胞比例顯著降低，并存在劑量效應(yīng)關(guān)系，提示DEB可降低細(xì)胞的HR修復(fù)效率。體外NHEJ修復(fù)檢測(cè)結(jié)果表明，隨著DEB處理濃度增加，線性化質(zhì)粒DNA連接產(chǎn)物明顯增加，提

11、示DEB可提高DNA雙鏈斷裂的NHEJ修復(fù)效率。此外，對(duì)DNA雙鏈斷裂損傷修復(fù)通路的蛋白表達(dá)檢測(cè)結(jié)果表明，HR通路BRCA1蛋白在DEB處理24 h時(shí)出現(xiàn)明顯降低。同時(shí)，NHEJ通路蛋白DNA-PKcs、XLF和DNA-ligaseⅣ的表達(dá)在DEB作用后4h或24 h后開始出現(xiàn)顯著升高。Westernblot檢測(cè)未發(fā)現(xiàn)NHEJ修復(fù)通路核心蛋白之一Ku80的表達(dá)改變，但是免疫熒光和Slotblot檢測(cè)顯示DEB處理細(xì)胞后4h，Ku80蛋白

12、形成聚焦灶，同時(shí)與DNA結(jié)合的Ku80含量顯著升高，并存在劑量效應(yīng)關(guān)系。上述結(jié)果提示DEB可降低HR修復(fù)通路效率及相關(guān)基因表達(dá)，但是提高NHEJ修復(fù)通路效率，以及相關(guān)基因表達(dá)或轉(zhuǎn)移結(jié)合到DNA的能力。
　　4.NHEJ通路參與DEB誘導(dǎo)的NPB形成
　　采用化學(xué)抑制劑和shRNA分別抑制DNA-PKcs和Ku80蛋白，通過(guò)CBMNT，觀察NHEJ通路在DEB誘導(dǎo)染色體損傷和NPB形成中的作用。檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與單純DEB處理組相比

13、，抑制DNA-PKcs表達(dá)可使DEB誘導(dǎo)的微核和核芽突比率顯著升高，而NPB比率顯著降低。同時(shí)，與轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照序列的細(xì)胞相比，在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Ku80 shRNA的細(xì)胞中，DEB也能誘導(dǎo)微核和核芽突比率進(jìn)一步升高，而NPB比率則顯著降低。這些研究結(jié)果提示，抑制DNA-PKcs或Ku80蛋白的表達(dá)可加重DEB所誘導(dǎo)的微核及核芽突損傷，但減低了NPB損傷的發(fā)生。這一結(jié)果也提示NHEJ通路可能參與了DEB所誘導(dǎo)的NPB的形成。
　　研究結(jié)論: