1,2：3,4-二環(huán)氧丁烷誘導細胞DNA雙鏈斷裂損傷及其修復機制研究.pdf

1、研究背景：
　　1，3-丁二烯(1，3-butadiene，BD)是一種重要的工業(yè)原料，用于合成橡膠、塑料等石油化工和制造行業(yè)。美國將BD列為前40位重要的化學品之一，應用范圍廣，職業(yè)接觸人群多。此外，汽車尾氣、香煙煙霧及食用油油煙中也發(fā)現(xiàn)BD普遍存在，屬于室內具有慢性空氣危害的9種優(yōu)先污染物之一。因此BD不僅是一種職業(yè)暴露污染物，更是一種重要的環(huán)境空氣污染物，其危害范圍已從職業(yè)工人擴展到普通人群。
　　BD可以誘導嚙齒動物

2、多器官腫瘤的形成，人群研究也顯示出白血病發(fā)病相關的陽性結果，因而被IARC和EPA列為確定的人類致癌物（1組）。BD的致癌效應主要來自于體內代謝產(chǎn)生的環(huán)氧化產(chǎn)物:1，2-環(huán)氧-3-丁烯(EB)，1，2-二羥基-3，4-環(huán)氧丁烯(EBD)和1，2:3，4-二環(huán)氧丁烯(DEB)。上述環(huán)氧化產(chǎn)物均能與DNA形成加合物，造成遺傳物質的損傷，其中DEB的活性最強，因而目前對BD致癌機制研究多聚焦于闡明其遺傳損傷效應。
　　既往研究發(fā)現(xiàn)BD及

3、其代謝物可以誘導DNA雙鏈斷裂和染色體損傷，但是BD誘導DNA雙鏈斷裂損傷后的修復機制并不清楚。本課題組前期在人群研究中發(fā)現(xiàn)BD暴露與核質橋(NPB)比例升高相關。NPB是染色體損傷的標志和細胞癌變的重要環(huán)節(jié)，研究BD誘導NPB形成的機制，將為闡明BD的致癌作用過程，預防和減少BD所誘導的染色體損傷和人群腫瘤的發(fā)生提供重要依據(jù)。有研究提示，NPB的形成可能與DNA雙鏈斷裂后，經(jīng)非同源末端連接(NHEJ)等錯誤修復形成雙著絲粒染色體，在細

4、胞分裂后期分別牽引到兩個子細胞核有關。由此我們推測，BD及其代謝物誘導DNA雙鏈斷裂后，可能通過影響主要的DNA雙鏈斷裂修復通路，即HR和NHEJ修復通路，造成錯誤修復效率的提高，從而引起NPB形成。因此，本課題以BD活性代謝物DEB為對象，在明確其誘導人淋巴母細胞DNA雙鏈斷裂和染色體損傷的條件下，研究DEB對DNA雙鏈斷裂修復通路的影響，進一步驗證修復通路在DEB致NPB形成中的作用，為深入探討B(tài)D的遺傳損傷機制提供依據(jù)。
　

5、　研究內容：
　　1.DEB的細胞毒性效應研究
　　建立DEB染毒處理的人淋巴母細胞TK6細胞模型模型。分別采用MTS和EdU方法檢測DEB對細胞活性和增殖能力的影響。采用流式細胞儀分析技術，分別以PI和AnnixⅤ-FITC/PI染色檢測DEB對細胞周期和細胞凋亡的影響。
　　2.DEB誘導細胞遺傳損傷的檢測
　　采用胞質分裂阻滯微核試驗(CBMNT)分析DEB對細胞染色體的損傷（微核率、核質橋率、核芽突率及核

6、分裂指數(shù)）;采用Western blot和免疫熒光技術，檢測DNA雙鏈斷裂標志物(γ-H2AX)的表達情況。
　　3.DEB對細胞DNA雙鏈斷裂損傷修復的影響
　　采用含有HR修復效率檢測報告底物的MCF-7細胞，檢測DEB處理后HR修復效率的變化。采用Cell-free方法，提取細胞總蛋白，與32p標記的線性質粒共同作用，檢測DEB處理后NHEJ修復效率的變化。采用Western blot、Slot blot或免疫熒光方法

7、檢測DNA損傷修復通路關鍵分子ATM、p-ATM、γ-H2AX、Ku80、DKA-PKcs、XLF、DNA-ligaseⅣ和BRCA1的表達，以觀察DEB對DNA雙鏈斷裂修復通路分子表達的影響。
　　4.NHEJ通路基因在DEB所致染色體損傷中的作用研究
　　采用化學抑制劑Nu7026處理細胞以抑制DNA-PKcs的表達，采用ShRNA轉染細胞以抑制Ku80的表達，通過CBMNT檢測細胞染色體損傷的變化，分析NHEJ通路在D

8、EB所致DNA雙鏈斷裂損傷修復及NPB形成中的作用。
　　研究結果：
　　1.DEB誘導TK6細胞增殖抑制、周期阻滯和細胞凋亡
　　DEB可以抑制TK6細胞的活力，降低DNA的合成，具有劑量效應關系。進一步通過流式細胞儀分析發(fā)現(xiàn)，DEB可以抑制TK6細胞的周期進展，使細胞分裂阻滯在G2/M期。同時，DEB處理可誘導TK6細胞凋亡，2.5～10μM DEB處理后48h，細胞凋亡率均出現(xiàn)顯著升高(P＜0.01或0.001)

9、。
　　2.DEB誘導TK6細胞的染色體損傷及DNA雙鏈斷裂
　　CBMNT檢測結果表明，DEB可誘導TK6細胞的微核率、核質橋率及核芽突率升高，造成細胞的染色體損傷，同時引起核分裂指數(shù)降低，抑制細胞增殖。此外，WesternBlot檢測發(fā)現(xiàn)，10μM DEB處理細胞后，DNA雙鏈斷裂標志物γ-H2AX蛋白的表達隨著時間的延長，先升高后降低，總體維持在一個高表達的水平。免疫熒光檢測也證實，10μM DEB處理可誘導細胞γ-H

10、2AX的大量表達。上述結果提示，DEB可造成TK6細胞的DNA雙鏈斷裂及染色體損傷。
　　3.DEB影響HR和NHEJ修復效率及相關基因的表達
　　采用含有pDR-GFP底物的細胞檢測DEB對HR修復效率的影響，結果顯示，DEB處理24 h后反映HR修復的熒光陽性細胞比例顯著降低，并存在劑量效應關系，提示DEB可降低細胞的HR修復效率。體外NHEJ修復檢測結果表明，隨著DEB處理濃度增加，線性化質粒DNA連接產(chǎn)物明顯增加，提

11、示DEB可提高DNA雙鏈斷裂的NHEJ修復效率。此外，對DNA雙鏈斷裂損傷修復通路的蛋白表達檢測結果表明，HR通路BRCA1蛋白在DEB處理24 h時出現(xiàn)明顯降低。同時，NHEJ通路蛋白DNA-PKcs、XLF和DNA-ligaseⅣ的表達在DEB作用后4h或24 h后開始出現(xiàn)顯著升高。Westernblot檢測未發(fā)現(xiàn)NHEJ修復通路核心蛋白之一Ku80的表達改變，但是免疫熒光和Slotblot檢測顯示DEB處理細胞后4h，Ku80蛋白

12、形成聚焦灶，同時與DNA結合的Ku80含量顯著升高，并存在劑量效應關系。上述結果提示DEB可降低HR修復通路效率及相關基因表達，但是提高NHEJ修復通路效率，以及相關基因表達或轉移結合到DNA的能力。
　　4.NHEJ通路參與DEB誘導的NPB形成
　　采用化學抑制劑和shRNA分別抑制DNA-PKcs和Ku80蛋白，通過CBMNT，觀察NHEJ通路在DEB誘導染色體損傷和NPB形成中的作用。檢測發(fā)現(xiàn)，與單純DEB處理組相比

13、，抑制DNA-PKcs表達可使DEB誘導的微核和核芽突比率顯著升高，而NPB比率顯著降低。同時，與轉染陰性對照序列的細胞相比，在穩(wěn)定轉染Ku80 shRNA的細胞中，DEB也能誘導微核和核芽突比率進一步升高，而NPB比率則顯著降低。這些研究結果提示，抑制DNA-PKcs或Ku80蛋白的表達可加重DEB所誘導的微核及核芽突損傷，但減低了NPB損傷的發(fā)生。這一結果也提示NHEJ通路可能參與了DEB所誘導的NPB的形成。
　　研究結論: