PKB-Akt調控腫瘤細胞DNA雙鏈斷裂損傷修復的分子機制及其靶向小分子抑制劑的研究.pdf

1、背景及目的： 本研究用Akt激酶活性分析法篩選出Excisanin A能在體外抑制Akt激酶的活性，并進一步深入探討了Excisanin A通過抑制Akt活性及阻斷其下游信號轉導途徑在體內、外發(fā)揮抗腫瘤作用，為Excisanin A的進一步優(yōu)化及研發(fā)提供理論和實驗依據(jù)。 方法： 用分子克隆技術及脂質體轉染法建立穩(wěn)定轉染或瞬時轉染的細胞株；用免疫熒光技術或Western blot法觀察細胞經低劑量放射線照射后γ—H

2、2AX聚焦點的形成或γ—H2AX蛋白的表達情況，并計數(shù)DNA雙鏈受損的陽性細胞；用Western blot法檢測細胞中Mrell，phospho—Akt，Akt，phospho—GSK3β和β—catenin蛋白的表達；用RT—PCR法檢測細胞中Mrell在mRNA水平的表達；用染色質免疫沉淀(ChIP)法檢測β—catenin/LEF與Mrell啟動子序列的特異性結合作用；用熒光素酶報告基因檢測Akt及β—catenin是否可以誘導M

3、rell啟動子的活性； 結果： 1、PKB/Akt影響腫瘤細胞修復放射線所致的DSBs損傷 1.1抑制PKB/Akt能降低腫瘤細胞對DSBs的修復能力 用4Gy的劑量照射CNE2/vector和CNE2/shRNA Akt1這兩組細胞使其產生DSBs，然后在不同的時間進行γ—H2AX聚焦點分析。免疫熒光結果發(fā)現(xiàn)照射后30min，這兩組細胞均呈現(xiàn)顯著的DNA雙鏈斷裂損傷，且統(tǒng)計學分析這兩組細胞DNA受損的陽

4、性細胞無區(qū)別。 1.2增強PKB/Akt的活性能提高腫瘤細胞對DSBs的修復能力 用2Gy的劑量照射HeLa/vector和HeLa/myr—Akt1這兩組細胞使其產生DSBs，然后在不同的時間進行γ—H2AX聚焦點分析。免疫熒光結果發(fā)現(xiàn)照射后30min，這兩組細胞均呈現(xiàn)顯著的DNA雙鏈斷裂損傷，且統(tǒng)計學分析這兩組細胞DNA受損的陽性細胞無區(qū)別。 2、PKB/Akt通過GSK3β/β—catenin/ LEF-1

5、途徑調控Mre11的表達 2.1 PKB/Akt調控腫瘤細胞中Mre11的表達 當用特異性靶向Akt1的siRNA或LY294002抑制CNE2細胞或MDA—MB—43細胞中Akt的表達或激活后，Mre11的表達隨之下調；而當HeLa細胞轉染了持續(xù)激活的Akt1質粒使Akt的活性增強后，Mre11的表達隨之上調；同時我們構建了包含Mre11啟動子核心區(qū)域的熒光素酶報告基因pGL3-Mre11質粒并進行了活性檢測。

6、 2.2 PKB/Akt通過作用于GSK—3β來參與調控β—catenin途徑 GSK—3β是Akt下游一個重要的靶分子。在CNE2細胞中，當Akt的磷酸化水平被LY294002抑制后，GSK—3β的磷酸化水平下調，β—catenin的表達也下降；在HeLa細胞中，外源轉入持續(xù)激活型myr—Akt1質粒增高細胞中Akt的磷酸化水平后，GSK—3β的磷酸化水平增加，β—catenin的表達隨之增強。 2.3β—caten

7、in通過轉錄因子LEF-1調控Mre11的表達 接下來我們又深入探討了β—catenin與Mre11之間的關系。當用特異性靶向β—catenin的siRNA抑制CNE2細胞及HeLa/myr—Akt1細胞中β—catenin的表達后，Mre11的表達隨之下調；而當HeLa細胞轉染了β—catenin的質粒使β—catenin過表達后，Mre11的表達隨之上調。ChIP實驗結果顯示β—catenin/LEF-1能在細胞內與Mre1

8、1啟動子區(qū)域的特異序列結合。熒光素酶報告基因結果顯示過表達β—catenin能使pGL3-Mre11的熒光素酶活性增高達50％，而過表達β—catenin卻不能使LEF-1位點發(fā)生突變的pGL3-mtMre11報告質粒的活性增高，這種差別具有顯著的統(tǒng)計學意義。與對照組的空白質粒相比，共轉染β—catenin表達質粒和野生型pGL3-Lef熒光素酶報告質?？梢允篃晒鈾z測活性增高達50％；若共轉染β—catenin表達質粒和突變型pGL3-

9、mtLef熒光素酶報告質粒，可使增高的活性下降近10倍。這些結果說明β—catenin可以通過轉錄因子LEF-1特異性地誘導Mre11啟動子的活性，從而上調Mre11的表達，也即證實了Mre11是β—catenin/ LEF-1的轉錄靶分子。 3、抑制Mre11的表達影響腫瘤細胞修復放射線引起的DSBs損傷 在實驗中，我們用2Gy放射線照射Mre11受干擾后的細胞及對照組細胞使其產生DSBs，然后在不同的時間進行γ—H2

10、AX聚焦點分析。免疫熒光結果發(fā)現(xiàn)照射后30min，這兩組細胞均呈現(xiàn)顯著的DNA雙鏈斷裂損傷，且統(tǒng)計學分析這兩組細胞DNA受損的陽性細胞無區(qū)別。到照射后24小時，這兩組細胞的DNA損傷得到了不同程度的修復，但Mre11表達受抑制的細胞中γ—H2AX聚焦點明顯較對照組細胞多且大。在另外一組實驗中我們也得到了類似的結果。當HeLa細胞中的Mre11被有效地抑制后，再接受低劑量照射，48小時后收蛋白，Western blot結果顯示γ—H2AX

11、的表達明顯高于對照組細胞。以上結果說明抑制Mre11的表達顯著損害了腫瘤細胞修復放射線所致的DSBs損傷的能力。 4、Excisanin A對Akt激酶活性的影響 用Akt激酶活性分析法篩選靶向Akt的小分子抑制劑，Western blot結果發(fā)現(xiàn)ExcisaninA能明顯GSK—3的磷酸化水平，而且隨著藥物濃度的增高，抑制越明顯；在20μM濃度時，ExcisaninA對phospho—GSK—3α/β的抑制率達到84％

12、，而陽性對照藥triciribine為67％。這說明ExcisaninA在體外能抑制Akt激酶的活性。 5、Excisanin A誘導Hep3B細胞和MDA—MB—453細胞發(fā)生凋亡，并在細胞內抑制Akt的活性及阻斷其下游信號轉導途徑 為探討Excisanin A的體外抗瘤作用及作用機制，我們選擇了Akt活性高表達的人肝癌Hep3B細胞及乳腺癌細胞MDA—MB—453細胞為細胞模型。MTT結果顯示Excisanin A能

13、顯著抑制Hep3B細胞及MDA—MB—453細胞的增殖，并呈劑量效應關系，其IC50(72 h)值分別為6.5μM(Hep3B細胞)和10.3μM(MDA—MB—453細胞)。而且Excisanin A能增強5-FU對Hep3B細胞或阿霉素對MDA—MB—453細胞的敏感性，其CIs值<1。當用Excisanin A處理Hep3B和MDA—MB—453細胞后，AnnexinV陽性的細胞比例顯著增加，且細胞核出現(xiàn)典型的凋亡改變。當用Exc

14、isaninA處理Hep3B細胞和MDA—MB—453細胞后，Western blot結果顯示胞內的Akt、FKHR、GSK—3β、mTOR的磷酸化水平在很短的時間內就被明顯抑制，并呈濃度依賴性和時間依賴性。為進一步證實ExcisaninA在細胞內能抑制Akt的活性，我們建立了穩(wěn)定轉染激活型myr—Akt1質粒的細胞株Hep3B/myr—Akt1。MTT結果顯示與對照組相比，ExcisaninA能明顯減少Hep3 B/myr—Akt1組

15、中存活的細胞。以上實驗結果說明Excisanin A在Hep3B細胞和MDA—MB—453細胞中通過抑制Akt的活性并使其底物蛋白FKHR、GSK—3β、mTOR去磷酸化，從而阻斷其下游信號轉導途徑，并啟動細胞凋亡的進程。 6、ExcisaninA在體內抑制Hep3B裸鼠移植瘤的生長并阻斷Akt/FKHR途徑 為探討Excisanin A的體內抗瘤藥效及作用機制，我們建立了Hep3B裸鼠移植瘤模型。結果顯示，Excisa

16、nin A在20mg/kg/d劑量下能顯著抑制Hep3B裸鼠移植瘤的生長，其抑瘤率達到46.4％。將瘤組織制成的冰凍切片進行TUNEL染色，在熒光顯微鏡下可觀察到20mg/kg/d Excisanin A處理組可見大量TUNEL染色呈陽性的細胞。而且Western blot及免疫熒光的結果也顯示20mg/kg/d Excisanin A處理組能抑制Hep3B裸鼠移植瘤中Akt和FKHR的磷酸化水平。這些結果說明Excisanin A在在

17、20 mg/kg/d劑量時能在體內阻斷Akt/FKHR信號傳導通路，使Akt和FKHR的磷酸化水平降低，從而誘導細胞發(fā)生凋亡。 結論： 1、抑制Akt可使腫瘤細胞修復放射線所致的DSBs損傷的能力減弱；而增強Akt的活性，可使腫瘤細胞對放射線所致的DSBs損傷的修復能力增強。 2、抑制Mre11的表達顯著損害了腫瘤細胞修復放射線所致的DSBs損傷的能力。 3、在腫瘤細胞中，激活的Akt能通過GSK3β/β