鈉離子通道阻斷劑利多卡因體內(nèi)外干預(yù)關(guān)節(jié)軟骨的生物學(xué)效應(yīng).pdf

1、隨著社會老齡化的發(fā)展及生活質(zhì)量的提高，骨關(guān)節(jié)炎越來越受到人們的重視。為了緩解關(guān)節(jié)疼痛及關(guān)節(jié)鏡手術(shù)中鎮(zhèn)痛的需要，臨床上常行關(guān)節(jié)腔內(nèi)利多卡因注射。國外報(bào)導(dǎo)布比卡因關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射引起了關(guān)節(jié)軟骨的溶解，利多卡因?qū)﹃P(guān)節(jié)軟骨的安全性越來越引起人們的重視。
　　 關(guān)節(jié)軟骨是透明軟骨，覆蓋在構(gòu)成活動關(guān)節(jié)的相對骨面。均勻傳遞負(fù)荷，擴(kuò)大關(guān)節(jié)負(fù)重面，緩沖震蕩，降低關(guān)節(jié)活動時(shí)的磨擦。關(guān)節(jié)軟骨沒有血管、神經(jīng)和淋巴管，自我修復(fù)能力很差。關(guān)節(jié)軟骨主要由軟骨細(xì)胞

2、和基質(zhì)構(gòu)成，其中軟骨細(xì)胞只占1％--10％，基質(zhì)的主要成份為水、蛋白多糖和II型膠原。軟骨細(xì)胞合成和分泌蛋白多糖和II型膠原，維持軟骨基質(zhì)的新陳代謝；基質(zhì)則圍繞在軟骨細(xì)胞周圍，使軟骨具有彈性和張力強(qiáng)度。軟骨細(xì)胞和基質(zhì)互為存在的條件，軟骨細(xì)胞的凋亡和壞死會影響基質(zhì)的合成和分泌；基質(zhì)的毀損將導(dǎo)致軟骨細(xì)胞的破壞。在正常情況下，基質(zhì)更新的速度很慢,基質(zhì)的合成和分泌處于動態(tài)平衡中，并受多種因子的調(diào)控，如MMPs與TIMPs的動態(tài)平衡是保證生理狀態(tài)

3、下基質(zhì)正常更新改建的關(guān)鍵，一旦平衡破壞則引發(fā)各種病理過程。
　　 軟骨細(xì)胞是非興奮細(xì)胞，細(xì)胞膜上存在的多種離子通道是細(xì)胞進(jìn)行各種生命活動的物質(zhì)基礎(chǔ)：轉(zhuǎn)運(yùn)細(xì)胞代謝必需的離子；調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外滲透壓；參與電沖動形成；參與信號傳遞，使有機(jī)體更好地適應(yīng)環(huán)境條件。離子通道的活性受多種調(diào)控因素的調(diào)節(jié)，有多種興奮劑與阻斷劑:如利多卡因、河豚毒特異性地阻斷Na+通道，四乙胺選擇性地阻斷K+通道。
　　 利多卡因是選擇性Na+通道阻滯劑，能夠

4、選擇性地阻斷電壓門控式Na+通道，抑制Na+內(nèi)流，同時(shí)對K+通道也有阻斷作用。造成靜息膜電位上升，使H+、Ca2+在細(xì)胞膜內(nèi)外電壓梯度的影響下內(nèi)流增加，PH值降低；同時(shí)由于細(xì)胞滲透壓降低，細(xì)胞功能受損。有文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)當(dāng)利多卡因干預(yù)濃度達(dá)0.1mmol/L時(shí)，即可阻斷軟骨細(xì)胞Na+通道，干預(yù)濃度大于2.5 mmol/L、時(shí)間超過48小時(shí)觀察到有細(xì)胞出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象，并認(rèn)為細(xì)胞凋亡緣于利多卡因的細(xì)胞毒性作用，并由此提出利多卡因時(shí)間及濃度依賴的細(xì)胞毒

5、性作用的理論。
　　 鑒于此，我們希望通過體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)觀察接近臨床濃度的利多卡因作用于兔膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞時(shí)軟骨細(xì)胞的活性、基質(zhì)的合成及分泌、炎性因子分泌以及關(guān)節(jié)軟骨形態(tài)的變化，以期獲得有益于臨床的資料，避免醫(yī)源性的關(guān)節(jié)軟骨損害。
　　 目的：
　　 為了進(jìn)一步揭示電壓門控式Na+通道阻滯劑利多卡因?qū)﹃P(guān)節(jié)軟骨的影響，我們設(shè)計(jì)了不同濃度、不同作用時(shí)限下利多卡因干預(yù)軟骨細(xì)胞的體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)，通過測定各種條件下關(guān)節(jié)軟骨細(xì)

6、胞活性、細(xì)胞外基質(zhì)合成、分泌、炎性因子含量及關(guān)節(jié)軟骨形態(tài)的變化，探求利多卡因安全濃度、劑量及療程，以期為臨床應(yīng)用提供借鑒。
　　 方法：
　　 2月齡新西蘭大白兔56只，隨機(jī)分為體外實(shí)驗(yàn)組和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)組。體外實(shí)驗(yàn)組：空氣栓塞處死。無菌手術(shù)切取雙膝關(guān)節(jié)軟骨，分離關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞。不同濃度、不同時(shí)限利多卡因干預(yù)軟骨細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測軟骨細(xì)胞凋亡率；ELISA 法檢測軟骨細(xì)胞分泌Ⅱ型膠原、GAG及MMP-3、TIMP-1的含量；

7、RT-PCR 檢測軟骨細(xì)胞內(nèi)Ⅱ型膠原、Aggrecan Mrna的表達(dá)。
　　 并對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)組：在兔膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注入接近臨床對應(yīng)濃度的利多卡因0.5ml，每周一次，分別于注射4周、12周、24周后，采取空氣栓塞處死動物，通過大體觀察、組織切片、免疫組化等方法觀察動物關(guān)節(jié)軟骨的變化；另外單次關(guān)節(jié)腔注射后，分別在注射后第1、2、4、8天檢測關(guān)節(jié)軟骨組織Ⅱ型膠原、Aggrecan Mrna的表達(dá)，然后對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析

8、。
　　 結(jié)果：
　　 體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　 1：利多卡因誘發(fā)軟骨細(xì)胞凋亡具有明顯的時(shí)間依賴性和濃度依賴性。2.5mmol/L 利多卡因干預(yù)軟骨細(xì)胞，觀察72小時(shí)無明顯凋亡。
　　 2：0.2mmol/L、2mmol/L 利多卡因干預(yù)軟骨細(xì)胞，0.2mmol/L組早期（第3天）抑制GAG分泌，晚期（第9天）GAG分泌明顯增加(p<0.05);利多卡因組與對照組相比Ⅱ型膠原的分泌有降低趨勢(p>0.05)。<

9、br>　　 2mmol/L組較對照組GAG及Ⅱ型膠原的分泌稍減少(p>0.05)。
　　 3：0.2mmol/L、2mmol/L 利多卡因干預(yù)軟骨細(xì)胞，0.2mmol/L組早期（第3天）抑制MMP-3分泌，晚期（第9天）MMP-3與對照組相比分泌明顯增加(p<0.05)；利多卡因組與對照組相比TIMP-1的分泌逐漸增高(p>0.05)。
　　 2mmol/L組軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液中MMP-3 含量與對照組相比明顯增加(p<0

10、.05)。而TIMP-1的含量無明顯變化(p>0.05)。
　　 4:2mmol/L 利多卡因干預(yù)軟骨細(xì)胞，Ⅱ型膠原Mrna的表達(dá)較對照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；
　　 早期（第3天）抑制Aggrecan Mrna的表達(dá)，晚期（第9天）Aggrecan Mrna與對照組相比表達(dá)明顯增加(p<0.05)。
　　 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　 1：利多卡因干預(yù)4周時(shí),兔膝關(guān)節(jié)軟骨大體形態(tài)、HE 染色及免疫組化與自體對照組均無差異

11、, 軟骨表面光滑，結(jié)構(gòu)完整，潮線清晰，軟骨細(xì)胞數(shù)量如常，排列整齊，未見壞死崩解的軟骨細(xì)胞；12周利多卡因與生理鹽水對照組組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn),細(xì)胞略大,番紅O 深染,盡管兩組對照軟骨厚度無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,但利多卡因組有增厚的趨勢；24周利多卡因組關(guān)節(jié)軟骨表面切線層受損，Mankin's 評分與生理鹽水對照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 2：5mmol/L 利多卡因干預(yù)后第一天Ⅱ型膠原Mrna的表達(dá)明顯增高，后表達(dá)量隨時(shí)間而下降，第8天與對照組相比