鈷納米顆粒對(duì)外周血T淋巴細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)及其機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：
　　 現(xiàn)代金屬-金屬(MOM)人工髖關(guān)節(jié)置換系統(tǒng)提高了假體的耐磨性和抗疲勞強(qiáng)度，在臨床上表現(xiàn)出優(yōu)良的早中期效果。作為植入材料，不可避免地面對(duì)機(jī)械物理、電化學(xué)腐蝕等多種因素造成的降解，形成具有化學(xué)活性的產(chǎn)物。大量研究表明，MOM術(shù)后患者血液、尿液中鈷、鉻離子濃度顯著升高。值得一提的是，假體周?chē)M織中發(fā)現(xiàn)超細(xì)直徑的金屬顆粒（6-834nm），主要是含鈷基的納米顆粒。病例研究顯示，部分翻修假體周?chē)霈F(xiàn)廣泛滑膜潰瘍伴淋巴細(xì)胞

2、、漿細(xì)胞浸潤(rùn)：“炎性假瘤”形成—含有血管、壞死組織及多核巨細(xì)胞的肉芽腫樣改變，且金屬磨屑沉淀其中，局部淋巴結(jié)凝固性壞死。同時(shí)，假體植入時(shí)間的延長(zhǎng)伴隨外周血淋巴細(xì)胞染色體易位率和染色體非整倍體率提高，T細(xì)胞、白細(xì)胞和骨髓細(xì)胞水平下降；部分患者血清中發(fā)現(xiàn)鈷、鉻特異性IgE。體外研究表明，金屬納米顆粒自身尺寸效應(yīng)帶來(lái)了有別于宏觀粒子及相應(yīng)離子的生物學(xué)效應(yīng)。因此，探討鈷納米顆粒(CoNPs)對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)的生物學(xué)效應(yīng)及其機(jī)制具有重要意義。

3、>　　 第一部分鈷納米顆粒對(duì)外周血T淋巴細(xì)胞的細(xì)胞毒性和遺傳毒性作用
　　 目的：
　　 研究鈷納米顆粒(CoNPs)對(duì)外周血T淋巴細(xì)胞的細(xì)胞毒性和遺傳毒性作用，同時(shí)以鈷離子(Co2+)作為比較研究，初步探討MOM術(shù)后一系列復(fù)雜生物學(xué)反應(yīng)的病因。
　　 方法：
　　 以正常外周血T淋巴細(xì)胞作為試驗(yàn)系統(tǒng)，采用不同濃度的CoNPs和Co2+對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理，在不同時(shí)間點(diǎn)利用3-(4,5-二甲基噻唑－2)－2,

4、5-二苯基四氦唑溴鹽(MTT)及乳酸脫氫酶(LDH)分析方法檢測(cè)細(xì)胞生存率，利用彗星試驗(yàn)(Comet assay)及微核試驗(yàn)(MNT)檢測(cè)細(xì)胞DNA和染色體損傷，評(píng)估CoNPs和Co2+的細(xì)胞毒性和遺傳毒性。同時(shí)，使用ICP-MS(Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry)檢測(cè)手段，評(píng)估CoNPs細(xì)胞外釋放離子的情況。
　　 結(jié)果：
　　 (1)CoNPs及Co2+對(duì)外周血

5、T淋巴細(xì)胞的細(xì)胞毒性效應(yīng)呈現(xiàn)時(shí)間、濃度依賴性。
　　 (2)CoNPs、Co2+細(xì)胞毒性起效濃度分別約為10、50μM,4hCC50分別為10、50μM，說(shuō)明CoNPs的細(xì)胞毒性效應(yīng)強(qiáng)于Co2+。
　　 (3)50、100μMCoNPs在4、24、48h釋放(％)分別為5.12±1.44、14.22±3.17、32.78±2.70及6.27±2.49、18.78±4.29、38.81±2.11，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)離子釋放逐步

6、增加，呈現(xiàn)時(shí)間依賴關(guān)系（P＜0.001）。各時(shí)間點(diǎn)釋放的濃度均小于Co2+細(xì)胞毒性起效濃度(50μM)，提示CoNPs的細(xì)胞毒性作用并不依賴于細(xì)胞外Co2+釋放。
　　 (4)LDH實(shí)驗(yàn)結(jié)果和MTT吻合。
　　 (5)CoNPs在3、6μM劑量，尾部DNA含量分別為8.73±4.60、9.64±4.77，Olive尾矩分別為2.16±1.19、9.66±4.73與溶劑對(duì)照組尾部DNA含量（1.46±0.76）和Olive

7、尾矩（0.35±0.21）相比均有顯著差異(P＜0.01);Co2+各劑量組尾部DNA含量和Olive尾矩與溶劑對(duì)照組相比均無(wú)顯著差異(P＞0.05)。結(jié)果說(shuō)明，CoNPs可以引起外周血T淋巴細(xì)胞DNA鏈斷裂，導(dǎo)致初始DNA損傷；本研究設(shè)計(jì)的濃度及染毒時(shí)間內(nèi)，未發(fā)現(xiàn)Co2+造成T淋巴細(xì)胞DNA損傷。
　　 (6)CoNPs在6μM劑量，微核率(BNMN(‰))為13.69±1.85，與對(duì)照組(5.46±1.28)相比有顯著差異(

8、P＜0.05);Co2+各劑量組微核率與對(duì)照組相比均無(wú)顯著差異(P＞0.05)。說(shuō)明CoNPs可以引起外周血T淋巴細(xì)胞染色體損傷；本研究設(shè)計(jì)的濃度及染毒時(shí)間內(nèi)，未發(fā)現(xiàn)Co2+造成T淋巴細(xì)胞染色體損傷。
　　 結(jié)論：
　　 (1)CoNPs可以對(duì)人免疫細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性及潛在遺傳毒性作用，可能是通過(guò)自身特殊動(dòng)力學(xué)行為介導(dǎo)，不依賴于細(xì)胞外Co2+釋放，且毒性作用強(qiáng)于Co2+。
　　 (2)試驗(yàn)結(jié)果部分解釋了MOM術(shù)后假

9、體周?chē)仔约倭鲂纬?、外周血免疫?xì)胞減少及染色體畸變的原因。
　　 (3)本研究無(wú)法排除CoNPs和Co2+是否存在協(xié)同效應(yīng)，有待后續(xù)深入探討。
　　 第二部分鈷納米顆粒對(duì)外周血T淋巴細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)機(jī)制的研究
　　 目的：
　　 研究CoNPs的表征特性、介質(zhì)中分散情況、是否能進(jìn)入細(xì)胞、細(xì)胞處理后的氧化應(yīng)激水平，初步探討CoNPs生物學(xué)效應(yīng)的機(jī)制。
　　 方法：
　　 以PBS及含血清培養(yǎng)基

10、作為溶劑，利用TEM觀測(cè)CoNPs分散情況，同時(shí)檢測(cè)CoNPs的粒徑分布。細(xì)胞經(jīng)過(guò)CoNPs處理后固定、脫水、浸、包埋、切片、染色，借助TEM觀測(cè)CoNPs進(jìn)入細(xì)胞的情況。CoNPs和Co2+分別對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染毒，采用熒光分光法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)水平、谷胱甘肽還原酶法檢測(cè)還原型谷胱甘肽(GSH)水平、鄰苯二酚氧化法檢測(cè)超氧化物歧化酶(SOD)活力、H2o2還原法檢測(cè)過(guò)氧化氫酶(CAT)活力、GSH氧化法檢測(cè)谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GP

11、x)活力。
　　 結(jié)果：
　　 (1)CoNPs在不同的溶劑中解聚情況有所區(qū)別：5%人AB血清RPMI-1640培養(yǎng)液為溶劑時(shí)解聚效果優(yōu)于PBS溶劑；同時(shí)，CoNPs的粒徑分布平均為50nm。
　　 (2)細(xì)胞胞漿中出現(xiàn)致密CoNPs團(tuán)塊，外形上類(lèi)似一整體的大尺寸顆粒，其電子密度高于細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞膜未見(jiàn)破壞，細(xì)胞核未見(jiàn)CoNPs積聚。
　　 (3)相比較對(duì)照組，CoNPs處理組相對(duì)熒光單位(RUF)升高具有

12、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），間接說(shuō)明CoNPs可以導(dǎo)致T淋巴細(xì)胞內(nèi)ROS明顯升高，自由基蓄積；Co2+處理組RUF升高無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 (4)CoNPs處理組GSH值8.74±2.41μM/mg protein，相比較對(duì)照組GSH值15.27±1.32μM/mg protein，差異顯著(P＜0.05)；Co2+處理組GSH值13.62±0.85μM/mg protein，無(wú)顯著差異（P＞0.05）。說(shuō)明Co

13、NPs可以導(dǎo)致T淋巴細(xì)胞內(nèi)GSH明顯下降，細(xì)胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài)。
　　 (5)CoNPs處理組SOD、CAT、GPx水平分別為8.92±0.57、6.33±0.46、6.15±0.64U/mg protein，相比較對(duì)照組12.46±1.02(SOD)、11.21±0.60(CAT)、11.87±0.89(GPx)U/mg protein，差異顯著(P＜0.05);Co2+處理組SOD、CAT、GPx水平分別為10.71±0.4

14、8、10.11±0.61、11.03±1.29U/mg protein，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0．05)。
　　 結(jié)論：
　　 (1)CoNPs血清懸浮體系穩(wěn)定性較高，有利于機(jī)體內(nèi)血液、淋巴液轉(zhuǎn)運(yùn)及生物學(xué)效應(yīng)作用。
　　 (2)CoNPs可以高效便捷地進(jìn)入T淋巴細(xì)胞，而不依賴細(xì)胞的吞噬功能。
　　 (3)CoNPs可引起外周血T淋巴細(xì)胞內(nèi)ROS蓄積，同時(shí)破壞細(xì)胞抗氧化防御機(jī)制，導(dǎo)致自由基的產(chǎn)生與清除處在失衡狀