HMGCS2、PPARγ在炎癥性腸病患者腸粘膜的表達(dá)與活性.pdf

1、研究背景與目的：
　　 潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC)是一種慢性非特異性結(jié)腸炎癥,病變主要累計(jì)結(jié)腸粘膜和粘膜下層,范圍多自結(jié)腸遠(yuǎn)端開(kāi)始。UC和克羅恩病(Crohn’s disease,CD)均屬炎癥性腸病(inflammatory bowel disease,IBD)之范疇。
　　 過(guò)去歐洲和北美人群中IBD發(fā)病率較高,亞洲人群發(fā)病率較低,然而近年來(lái)IBD在亞洲人群中的發(fā)病呈現(xiàn)明顯增高趨勢(shì).I

2、BD的發(fā)病機(jī)制仍然不甚清楚,目前研究認(rèn)為可能與遺傳易感人群在持續(xù)腸道感染、腸黏膜屏障缺陷和環(huán)境改變等多因素作用下引起的腸道免疫系統(tǒng)異常反應(yīng)相關(guān)。
　　 國(guó)內(nèi)隊(duì)列研究顯示,吸煙、闌尾切除、腸道感染影響IBD的發(fā)生；飲茶、母乳喂養(yǎng)為UC的保護(hù)因素；高學(xué)歷與城市人群中IBD較多；副結(jié)核分枝桿菌感染可能與CD有關(guān)。近年來(lái)研究表明腸黏膜屏障功能異常與IBD發(fā)病關(guān)系密切。腸腔表面積很大,由上皮細(xì)胞緊密連接而成,長(zhǎng)期暴露于各種食物成分、共生菌

3、及病原菌.腸道上皮有重要的屏障功能,在多數(shù)情況下,上皮細(xì)胞對(duì)各種損傷穩(wěn)定應(yīng)答,炎癥處于限制狀態(tài)。IBD發(fā)生時(shí),腸黏膜屏障功能障礙,黏膜通透性增高,導(dǎo)致腸腔內(nèi)細(xì)菌、抗原等物質(zhì)移位至黏膜固有層而激活免疫細(xì)胞,誘導(dǎo)黏膜過(guò)度免疫反應(yīng)的發(fā)生,繼而進(jìn)一步破壞腸黏膜屏障,加重黏膜異常免疫反應(yīng),從而導(dǎo)致IBD的發(fā)生。
　　 一般情況下UC和CD可以根據(jù)臨床表現(xiàn)、實(shí)驗(yàn)室和放射學(xué)檢查、內(nèi)鏡和組織學(xué)特征綜合分析鑒別并不困難。對(duì)于結(jié)腸炎癥性腸病一時(shí)難以

4、區(qū)別UC與CD者,臨床可以診斷為IBD類型待定(type unclassified,IBDU),觀察病情變化,但是如果結(jié)腸廣泛病變,并且內(nèi)鏡、病理表現(xiàn)不典型時(shí),UC和CD有時(shí)難以鑒別；如果IBD內(nèi)鏡下炎癥表現(xiàn)較輕,無(wú)典型內(nèi)鏡下改變,還需要與腸道感染性疾病相鑒別。CD、腸結(jié)核(intestinal tuberculosis,ITB)、腸道淋巴瘤(intestinallymphoma,IL)、腸型白塞氏病(intestinal Beheet

5、's disease,BD)因?yàn)閮?nèi)鏡下存在諸多相似的地方,這幾個(gè)疾病之間的鑒別也是臨床的一個(gè)難題。
　　 目前,臨床上尚未有簡(jiǎn)單易行的實(shí)驗(yàn)室方法來(lái)鑒別診斷IBD:血常規(guī)、血漿蛋白、電解質(zhì)、ESR、C-反應(yīng)蛋白,有條件的單位也可以做糞便鈣衛(wèi)蛋白、乳鐵蛋白、α1抗胰蛋白酶等檢查,但是這些檢查的都無(wú)特異性。影像學(xué)檢查包括胃腸鋇劑造影、腹部超聲、CT、MRI等對(duì)IBD的診斷有所幫助。
　　 我們課題組前期運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù),篩選

6、出UC與正常人腸道黏膜差異蛋白若干,其中就包括3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A合成酶2(3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA synthase2,HMGCS2)
　　 PPARγ是一種細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子,即過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator-activated receptor,PPAR)的一員,根據(jù)結(jié)構(gòu)的不同,PPAR可分為αβ(或δ)和γ三種類型,其基因分別位于人類2

7、2,6和3號(hào)染色體上,通常PPARα高表達(dá)具有豐富線粒體和β氧化活性的組織,如肝、腸粘膜、腎臟皮質(zhì)和心臟,而在一些其它組織也發(fā)現(xiàn)了PPARα的低水平表達(dá)；PPARγ則于脂肪組織、膀胱及腸道中有高水平表達(dá)；而PPARβ幾乎在所有組織中均有低水平的表達(dá)。PPARγ通過(guò)調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá),在脂肪形成、糖脂代謝,以及在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用,并與多種疾病如糖尿病、肥胖、高血壓、腦缺血、帕金森病、腎臟疾病、癌癥等的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。目前國(guó)內(nèi)外有關(guān)P

8、PARγ與IBD的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究有一定的報(bào)道,絕大部分研究結(jié)果支持PPARγ是IBD的保護(hù)因子,但也有持有相反的觀點(diǎn),認(rèn)為預(yù)先用PPARγ激動(dòng)劑處理過(guò)的動(dòng)物模型后會(huì)加重動(dòng)物的腸道炎癥程度,引起更多的潰瘍、腺管喪失和水腫。雖然體外動(dòng)物實(shí)驗(yàn)有不少關(guān)于PPARγ與IBD的報(bào)道,但是目前僅有少量實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)了PPARγ受體在UC和CD患者中的表達(dá)及作用。
　　 HMGCS2即3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A合成酶2,調(diào)節(jié)酮體的生成的關(guān)鍵酶,在肝

9、臟組織及有些肝外組織如骨骼肌,心臟,胰腺、睪丸、結(jié)腸中均有表達(dá),HMGCS2在這些組織中表達(dá)的作用有待于進(jìn)一步闡明。然而在組織中,HMGCS2可以氧化脂肪酸,HMGCS2表達(dá)可以阻止乙酰輔酶A的沉積,反過(guò)來(lái)又可以減弱脂肪酸的氧化速率。結(jié)腸的生酮作用與HMGCS2表達(dá)有關(guān),后者取決于腸道生成的丁酸鹽量,在健康的腸上皮細(xì)胞,丁酸鹽刺激細(xì)胞的增殖,然而,在該組織中的腫瘤細(xì)胞系它又可以減少增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞分化和凋亡,國(guó)外有學(xué)者提出用于解釋“丁酸鹽

10、矛盾”,該假說(shuō)認(rèn)為:健康的腸粘膜有效地分解丁酸鹽,從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)丁酸鹽濃度的下降,因而阻止增殖的能力下降,在結(jié)腸癌細(xì)胞系中分解丁酸鹽的能力缺失,在這種背景下有學(xué)者提出HMGCS2的誘導(dǎo)缺乏導(dǎo)致了脂肪酸的beta氧化減弱。丁酸鹽是結(jié)腸粘膜的主要燃料來(lái)源,而且有證據(jù)顯示在潰瘍性結(jié)腸炎中氧化受損,在活動(dòng)期和靜止期的UC中丁酸鹽氧化生成CO2和酮體的量明顯低于健康對(duì)照組,并且這種減少與疾病的狀態(tài)有關(guān)。丁酸鹽的氧化缺陷反映了UC患者的可變又明確的

11、代謝缺陷,丁酸鹽的氧化減少可以解釋在結(jié)腸炎癥的分布特點(diǎn),特別是結(jié)腸末端的發(fā)病頻率。一般認(rèn)為脂肪酸(n-丁酸鹽)的氧化缺陷是結(jié)腸粘膜能量缺乏的一種表現(xiàn)。HMGCS2的誘導(dǎo)缺乏導(dǎo)致了脂肪酸(n-丁酸鹽)的beta氧化減弱,UC患者存在丁酸鹽氧化缺陷,由于丁酸鹽氧化生成酮體和CO2,我們?cè)O(shè)想作為酮體生成的關(guān)鍵酶HMGCS2在UC患者粘膜中也存在下調(diào)。HMGCS2在UC、CD患者腸粘膜中的表達(dá)及其作用至今沒(méi)有什么研究報(bào)道。因此,本次實(shí)驗(yàn)的目的是

12、希望通過(guò)對(duì)UC、CD及正常健康對(duì)照組中進(jìn)行HMGCS2、PPARγ分子標(biāo)志的系統(tǒng)檢測(cè),觀察相對(duì)完整的HMGCS2、PPARγ在這兩種疾病中的表達(dá)情況,從而推測(cè):①它們是否能作為鑒別UC、CD的標(biāo)志物；②它們是否與腸道能量代謝障礙及菌群失調(diào)相關(guān)；③通過(guò)對(duì)UC、CD及健康對(duì)照組比較,分析其IBD發(fā)生發(fā)展的分子學(xué)基礎(chǔ)。
　　 材料和方法
　　 1.完全隨機(jī)收集73例UC、42例CD、89例健康對(duì)照者的腸粘膜,比較UC組和CD組

13、之間一般臨床特點(diǎn)和檢查資料的差異,包括患者性別、年齡、病變累及部位、活動(dòng)分期、臨床分度、內(nèi)鏡檢查特點(diǎn)、發(fā)病時(shí)間等。
　　 2.用免疫組織化學(xué)染色技術(shù)觀察HMGCS2、PPARγ在上述各組的表達(dá)情況。
　　 3.統(tǒng)計(jì)分析:采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,用Independent-Samples TTest比較測(cè)定組和組之間患者年齡的差異；用R*C表資料的x2檢驗(yàn)比較各組間蛋白表達(dá)陽(yáng)性率的差異性；利用兩獨(dú)立樣本非參數(shù)檢

14、驗(yàn)、多個(gè)獨(dú)立樣本非參數(shù)檢驗(yàn)、Mann-Whitney U test比較各組之間性別、年齡、病變部位、分期、臨床分度、內(nèi)鏡分級(jí)等與蛋白染色表達(dá)的差異,所有分析結(jié)果取雙側(cè)P值,P<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1.73例UC中其中男46例.女27例,男:女=1.70:1,年齡13-77歲,平均年齡為(40.07±14.39)歲,發(fā)病的高峰年齡是30-49歲,其中發(fā)生在直腸的28例(38.4％),發(fā)生在

15、直乙狀結(jié)腸9例(12.3％),發(fā)生在全結(jié)腸的25例(34.2％)。42例CD患者有29例發(fā)生在回末和小腸(69.0％)。
　　 2.HMGCS2、PPARγ在73例UC患者腸粘膜中陽(yáng)性表達(dá)分別為48例(65.8％)和36例(49.3％)；在42例CD患者腸粘膜中陽(yáng)性表達(dá)分別為37例(88.1％)和30例(71.4％)；在89例正常對(duì)照組腸粘膜陽(yáng)性表達(dá)占82例(92.1％)和66例(74.2％)。HMGCS2、PPARγ在UC患者

16、中腸粘膜與正常健康對(duì)照組或CD患者腸粘膜比較明顯下降(P<0.01),但是在CD患者及健康對(duì)照組腸粘膜的HMGCS2、PPARγ表達(dá)沒(méi)有顯著性差異(HMGCS2:P=0.521、PPARγ:P=0.742)。
　　 3.HMGCS2、PPARγ在UC活動(dòng)期患者的腸粘膜表達(dá)顯著小于緩解期腸粘膜的表達(dá),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(HMGCS2:P=0.002、PPARγ:P=0.008)。
　　 4.HMGCS2、PPARγ在UC患

17、者腸粘膜的表達(dá)與患者性別、年齡、發(fā)病部位、臨床分度等無(wú)明顯相關(guān)性。PPARγ蛋白的表達(dá)與UC患者的內(nèi)鏡下分級(jí)無(wú)明顯相關(guān)性,但是HMGCS2蛋白的表達(dá)與內(nèi)鏡分級(jí)有關(guān),內(nèi)鏡分級(jí)較低也就是疾病炎癥較輕時(shí)該蛋白表達(dá)相對(duì)較高。
　　 結(jié)論:
　　 本研究發(fā)現(xiàn)HMGCS2、PPARγ不是IBD特異性蛋白指標(biāo),也存在于健康對(duì)照組等腸粘膜中,對(duì)于鑒別UC、CD具有一定的意義,有可能作為UC嚴(yán)重程度的一個(gè)指標(biāo)。HMGCS是酮體生成的關(guān)鍵酶