載基因殼聚糖納米粒的初步研究.pdf

1、載基因殼聚糖納米粒的初步研究本研究選用殼聚糖為載體材料，以pORF-lacZ為模型基因，研制了載基因殼聚糖納米粒，對其制備工藝，理化性質、載藥機理、體外基因傳輸性能及生物安全性進行了較為系統的研究。 采用單凝聚法制備了殼聚糖空白納米粒。以單因素法考察了殼聚糖濃度、三聚磷酸鈉濃度，反應溫度，介質pH值對平均粒徑的影響。較優(yōu)因素水平下制備的空白殼聚糖納米粒的平均粒徑為136.5±26.41nm，PDI為0.152。粒度分布均勻，粒徑

2、大部份集中于90～160nm間，透射電鏡觀察表明納米粒形態(tài)多呈球形。 采用復凝聚法制備載基因殼聚糖納米粒。在制備空白殼聚糖納米粒的基礎上，以強度平均粒徑、包封率和載藥量為指標分別考察了殼聚糖濃度，三聚磷酸鈉濃度、質粒基因濃度等因素對各考察指標的影響。結果表明殼聚糖濃度和質粒基因濃度對制備工藝影響顯著。因此，將殼聚糖濃度X1和基因濃度X2作為考察因素，采用中心組合設計和效應面法對制備工藝進行了優(yōu)化。優(yōu)化指標選擇強度平均徑、多分散度

3、(PDI)、Zeta電位、包封率、載藥量和總評歸一值(OD)，采用兩因素五水平的中心組合設計和效應面法對制備條件進行優(yōu)化，確定了制備較佳條件[X1(Cs)=400ug/ml，X2(DNA)=110ug/m1]。預測值與實測值的偏差分別為1.89％，-4.22％，-6.34％，0.24％，-1.8％，-1.65％，表明建立的數學模型具有良好的預測性。較優(yōu)條件下制備三批納米粒樣品各優(yōu)化指標測定結果的RSD值分別為1.18％，4.79％，2.

4、41％,1.70％，2.80％，0.54％，表明優(yōu)選制備工藝穩(wěn)定，重現性良好。 形態(tài)及表面性質評價結果表明載基因殼聚糖納米粒的形態(tài)比較規(guī)則，大多呈球形；平均粒徑較小(約200nm)且分布較為均勻(PDI≤0.2)。Zeta電位測定結果表明基因殼聚糖納米粒表面帶有一定強度的正電荷(約25mV)。藥物狀態(tài)與含量評價結果表明殼聚糖與質粒DNA間具有較強的結合能力，三批供試品包封率均大于90％，載藥量均大于50％。體外穩(wěn)定性評價結果表明

5、，質粒DNA在各種工藝拆分條件下均較為穩(wěn)定，DNA的超螺旋結構未遭破壞；載基因殼聚糖納米粒能夠長時間(4h)有效保護質粒DNA不被高濃度的DNA酶降解；小牛血清對其穩(wěn)定性具有濃度依賴性的明顯影響；常規(guī)儲存條件(室溫或4℃)下，24小時內即可發(fā)生較為明顯的聚集。載藥機理初步研究結果表明：殼聚糖分子與質粒DNA間通過非特異性的靜電結合形成殼聚糖-質粒DNA復合物，在STPP的脫水作用下發(fā)生急劇聚集，將質粒DNA包裹形成粒度約200nm的納米

6、粒；同時，未與質粒DNA靜電結合的游離殼聚糖分子間通過相互間的聚集而將質粒DNA包裹。極少數未被包裹的質粒DNA則可通過非特異性的靜電作用吸附于納米粒表面。 制備了載基因殼聚糖納米粒的凍干品。凍干保護劑篩選結果表明最佳凍干保護劑為5％～10％的乳糖。采用冷凍干燥技術可以將其穩(wěn)定貯存期提高至3個月。 選用LoVo細胞(人結腸腺癌細胞)評價了體外基因傳輸性能。轉染的LoVo細胞經X-gal染色后部份細胞呈藍色，陰性對照即裸質

7、粒組沒有觀測到表達產物，證明采用殼聚糖為載體制備載基因納米粒傳遞外源性質粒DNA具有可行性。隨著殼聚糖納米粒與LoVo細胞間作用時間的增加，轉染率呈現先增加，再逐漸降低的趨勢，較佳的相互作用時間應為3～6h。體外轉染效率隨劑量增加呈上升趨勢，具有劑量依賴性。 通過四甲基偶氮唑鹽(MTT)比色法、細胞集落形成試驗和溶血性試驗對自制載基因殼聚糖納米粒的初步體外安全性評價結果表明載基因殼聚糖納米粒在各試驗濃度均無細胞毒性，對單個細胞增