14,15-EET通過調(diào)控中性粒細胞的浸潤和功能促進機體轉(zhuǎn)移休眠潛伏病灶的發(fā)展.pdf

1、目的：腫瘤休眠是腫瘤轉(zhuǎn)移和復發(fā)的關鍵。當微環(huán)境變成適應腫瘤生長的狀態(tài)時，腫瘤的休眠狀態(tài)可以被逆轉(zhuǎn)。然而，花生四烯酸的代謝產(chǎn)物表氧化二十碳三烯酸之一14,15-EET可以促進休眠病灶的發(fā)展；因此，本文旨在探討14,15-EET是否可以作為一種生理因子調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境，從而促進微小休眠病灶的再生長，以及14,15-EET調(diào)控微環(huán)境促進微小休眠病灶發(fā)展的具體機制。
　　方法：⑴用TGF-β1/H2O2/HOCl(T/H/H)-刺激以后的非

2、轉(zhuǎn)移性腫瘤細胞尾靜脈接種三周以后建立微小休眠轉(zhuǎn)移模型，再尾靜脈給藥14,15-EET到第6周后通過觀察肺表明的宏觀結節(jié)以及 H&E染色評價14,15-EET是否可以促進微小休眠病灶的發(fā)展。⑵用軟瓊脂集落形成實驗來檢測14,15-EET處理以后腫瘤細胞增殖的情況，用Real-time PCR檢測體內(nèi)體外14,15-EET刺激腫瘤細胞后血管相關基因Vegfa/VEGFA、Mmp9/MMP9的表達，用免疫熒光觀察腫瘤病灶中血管生成的情況。用M

3、MP9KO小鼠進一步確定MMP-9是來自非腫瘤細胞的。⑶用免疫組織化學技術檢測14,15-EET處理以后轉(zhuǎn)移模型中腫瘤結節(jié)周圍中性粒細胞的浸潤情況。用Real-time PCR檢測14,15-EET處理后肺組織中性粒細胞相關基因 Itgam（CD11b）、Ly6g（Ly6G）的表達。用單克隆抗體清除中性粒細胞后判斷14,15-EET是否還能促進微小潛伏病灶的發(fā)展。⑷檢測14,15-EET促進病灶處中性粒細胞浸潤的機制。用Real-tim

4、e PCR檢測14,15-EET刺激腫瘤細胞后中性粒細胞趨化因子相關基因 Cxcl1（CXCL1）、Cxcl2（CXCL2）、Cxcl5（CXCL5）、Cxcl15（CXCL8）、Ccl2（CCL2）、Ccl3（CCL3）、Ccl4（CCL4） Ccl5（CCL5）、GM-CSF（csf2）的表達情況。用 IL-8 shRNA抑制 IL-8的上調(diào)后判斷其對 PMN的趨化作用。ELISA檢測14,15-EET處理腫瘤細胞以后 IL-8的表

5、達。Western bloting檢測14,15-EET激活腫瘤細胞相關信號途徑水平。⑸檢測14,15-EET促進IL-8分泌相關miRNAs的表達情況及其機制。Real-time PCR檢測14,15-EET刺激后所有與 IL-8翻譯和分泌相關 miRNAs的表達。Western bloting檢測14,15-EET刺激后miR-155靶蛋白DET1、SHIP-1的變化。用miR-155 inhibitor判斷其對IL-8表達和分泌的

6、影響。⑹免疫組化檢測腫瘤細胞單純轉(zhuǎn)染pIL-8后尾靜脈接種到小鼠體內(nèi)對中性粒細胞的浸潤和對微小潛伏病灶的影響。⑺檢測14,15-EET改變中性粒細胞功能的作用效果。分離14,15-EET處理后小鼠的骨髓中性粒細胞和腹腔中性粒細胞與腫瘤細胞混合接種，根據(jù)瘤重評價中性粒細胞的促瘤效果。用 Real-time PCR檢測14,15-EET刺激中性粒細胞后 Trail、Mmp9基因的變化。用明膠酶譜檢測14,15-EET刺激中性粒細胞后活性MM

7、P9的表達。用Western bloting檢測14,15-EET刺激中性粒細胞后STAT3、TRAIL的表達。ELISA檢測14,15-EET處理小鼠后血清 IL-6和 G-CSF的變化。
　　結果：①非侵襲性腫瘤細胞、T/H/H-非侵襲腫瘤細胞、非侵襲性腫瘤接種+14,15-EET尾靜脈注射組6周后都沒有大的轉(zhuǎn)移病灶形成和肉眼可見結節(jié)，只有 T/H/H-非侵襲性腫瘤細胞接種+3周后14,15-EET尾靜脈注射組6周后，肺組織表

8、明可見結節(jié)和H&E染色后可見大的轉(zhuǎn)移病灶。②14,15-EET刺激組，軟瓊脂集落變大且數(shù)量也多于非刺激組。14,15-EET體內(nèi)體外刺激均不能上調(diào)腫瘤細胞 Vegfa/VEGFA的表達，但是尾靜脈注射14,15-EET組的肺組織Mmp-9表達上調(diào)，體外刺激腫瘤細胞卻沒有達到相應的上調(diào)水平。在尾靜脈接種的MMP9KO小鼠即使尾靜脈注射14,15-EET，腫瘤病灶也只能有限的增大并不能形成肉眼可見的結節(jié)和大的轉(zhuǎn)移病灶。免疫熒光結果顯示在 W

9、T小鼠接種和尾靜脈注射14,15-EET組病灶處可見明顯的新生血管，但是在MMP9KO小鼠和其他組均未見血管。③Control、14,15-EET、T/H/H刺激組免疫組化和Real-time PCR結果均顯示沒有PMN浸潤，只有T/H/H刺激組+14,15-EET組可見中④（4） Real-time結果顯示在所有中性粒細胞趨化因子中，14,15-EET主要上調(diào)Il8，ELISA結果也表明14,15-EET上調(diào)IL-8的表達。IL-8

10、shRNA轉(zhuǎn)染細胞以后，14,15-EET不能引起中性粒細胞的浸潤。Western bloting結果表明14,15-EET主要激活 STAT3、JNK這兩條信號通路。⑤14,15-EET可以上調(diào) miR-155的上調(diào)，不能上調(diào)其他miRNAs的表達。Western bloting結果顯示14,15-EET刺激后腫瘤細胞中DET1和SHIP-1均下調(diào)。加入miR155 inhibitor后，14,15-EET上調(diào)IL-8的作用減弱。⑥p

11、IL-8轉(zhuǎn)染非侵襲性腫瘤細胞以后，尾靜脈接種6周后并未見有結節(jié)和病灶，但肺組織中有中性粒細胞的浸潤。⑦14,15-EET處理后的小鼠骨髓中性粒細胞和腹腔中性粒細胞均有促瘤生長的作用，并且血清IL-6和G-CSF均上調(diào)。14,15-EET刺激中性粒細胞后STAT3被激活，sTRAIL下調(diào)，MMP-9上調(diào)。
　　結論：14,15-EET可以促進體內(nèi)微小休眠潛伏病灶的發(fā)展。其主要機制是通過激活腫瘤細胞內(nèi)miR-155和JNK/STAT3