中性粒細(xì)胞在胃癌中的分布、調(diào)控及免疫抑制功能的初步研究.pdf

1、中性粒細(xì)胞在宿主抗感染免疫中發(fā)揮著重要作用。當(dāng)局部組織發(fā)生感染時(shí),中性粒細(xì)胞滲出血管,到達(dá)感染部位,吞噬并殺死入侵的病原微生物,同時(shí)引起組織損傷和炎癥反應(yīng)。臨床證據(jù)和試驗(yàn)結(jié)果均提示,中性粒細(xì)胞數(shù)量的增加與腫瘤預(yù)后密切相關(guān),中性粒細(xì)胞在腫瘤中的作用也引起了越來越多的關(guān)注。
　　在腫瘤微環(huán)境中存在著N1型(抑瘤)和N2型(促瘤)兩種腫瘤相關(guān)中性粒細(xì)胞。這兩種腫瘤相關(guān)中性粒細(xì)胞在調(diào)控誘導(dǎo)、表型功能等方面存在明顯差異。N1型腫瘤相關(guān)中性粒

2、細(xì)胞與抗感染免疫中的中性粒細(xì)胞在表型和功能上都很相似。這種表型的中性粒細(xì)胞,其與免疫激活相關(guān)的細(xì)胞因子及趨化因子表達(dá)增加,而與免疫抑制相關(guān)的分子如精氨酸酶則表達(dá)降低,因此,也就具有了更強(qiáng)的腫瘤殺傷作用。N2型腫瘤相關(guān)中性粒細(xì)胞則通過分泌血管生成因子和基質(zhì)降解酶類來抑制機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng),進(jìn)而發(fā)揮促進(jìn)腫瘤生長的效應(yīng)。
　　胃癌是全球發(fā)生率第四、死亡率第二的惡性腫瘤,預(yù)后很差。腫瘤微環(huán)境中浸潤的免疫細(xì)胞的類型、數(shù)量以及浸潤部位與多種

3、腫瘤,包括胃癌的預(yù)后密切相關(guān),而在多種腫瘤中均發(fā)現(xiàn)了中性粒細(xì)胞的浸潤,腫瘤相關(guān)中性粒細(xì)胞的作用也慢慢得到了越來越多的重視。目前對(duì)中性粒細(xì)胞與胃癌的研究主要集中在中性粒細(xì)胞與胃癌預(yù)后的關(guān)系上,而對(duì)中性粒細(xì)胞在胃癌中的調(diào)控、作用及作用機(jī)制研究甚少。
　　目的:
　　1.分析胃癌患者外周血中及不同類型胃組織中的中性粒細(xì)胞的分布情況。
　　2.研究胃癌微環(huán)境對(duì)中性粒細(xì)胞的調(diào)控。
　　3.初步探討胃癌組織培養(yǎng)上清誘導(dǎo)的條件

4、性中性粒細(xì)胞的免疫抑制功能。
　　方法:
　　1.胃癌患者與健康成人外周血中性粒細(xì)胞頻率檢測(cè)及分析
　　收集胃癌患者和健康成人外周血,分別用抗人CD45和抗人CD66b流式抗體進(jìn)行染色,用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。分析每個(gè)個(gè)體外周血 CD45+CD66b+的中性粒細(xì)胞占CD45+白細(xì)胞的比例,并對(duì)所有的結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　2.胃癌患者不同類型胃組織中中性粒細(xì)胞的頻率檢測(cè)及分析
　　收集胃癌患者的不同類型胃組

5、織標(biāo)本制成單細(xì)胞懸液,分析每個(gè)個(gè)體不同類型胃組織(胃癌、癌旁及正常胃組織)中CD45+CD66b+的中性粒細(xì)胞占CD45+白細(xì)胞的比例,并對(duì)所有的結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　3.胃癌患者不同類型胃組織中中性粒細(xì)胞的原位檢測(cè)及分析
　　將胃癌組織、癌旁組織和正常胃組織標(biāo)本制成石蠟切片,用鼠抗人CD15抗體對(duì)石蠟切片中的中性粒細(xì)胞進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色,光學(xué)顯微鏡下觀察著色情況。
　　4.胃癌患者與健康成人外周血中性粒細(xì)胞表面

6、趨化因子受體分析
　　收集胃癌患者和健康成人外周血,分別用抗人CD45、抗人CD66b、抗人CXCR2及抗人 CXCR4流式抗體進(jìn)行染色,用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè),分析其表面趨化因子受體的表達(dá)。
　　5.胃癌患者不同類型胃組織浸潤的中性粒細(xì)胞表面趨化因子受體分析
　　收集胃癌患者不同類型胃組織標(biāo)本制成單細(xì)胞懸液,流式檢測(cè)中性粒細(xì)胞表面趨化因子受體CXCR2及CXCR4的表達(dá)情況。
　　6.胃癌組織培養(yǎng)上清和正常胃組織

7、培養(yǎng)上清誘導(dǎo)的條件性中性粒細(xì)胞的壽命檢測(cè)
　　分別用30％胃癌組織培養(yǎng)上清(30%TCS)、30%正常胃組織培養(yǎng)上清(30%NTCS)及完全1640培養(yǎng)基刺激健康成人外周血中性粒細(xì)胞12 h后,用7-氨基放線菌素(7-AAD)檢測(cè)誘導(dǎo)的條件性中性粒細(xì)胞的生存情況。
　　7.胃癌組織培養(yǎng)上清和正常胃組織培養(yǎng)上清誘導(dǎo)的條件性中性粒細(xì)胞免疫抑制功能研究
　　分別用30%胃癌組織培養(yǎng)上清(30%TCS)和30%正常胃組織培養(yǎng)上

8、清(30%NTCS)刺激健康成人外周血中性粒細(xì)胞12 h后,得到的條件性中性粒細(xì)胞與從正常人外周血中磁珠分選得到的CD3+T細(xì)胞共培養(yǎng)5 d后,收集細(xì)胞檢測(cè)T細(xì)胞增殖能力。
　　結(jié)果:
　　1.收集53例胃癌患者外周血和50例健康成人外周血,流式檢測(cè) CD45+CD66b+中性粒細(xì)胞占CD45+白細(xì)胞的比例,統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示胃癌患者外周血中性粒細(xì)胞比例明顯高于健康成人(78.72%±1.19%vs66.09%±1.17%,

9、 P<0.0001)。
　　2.收集53例胃癌患者不同類型胃組織(胃癌、癌旁及正常胃組織)標(biāo)本,流式檢測(cè)胃組織標(biāo)本中CD45+CD66b+中性粒細(xì)胞占CD45+白細(xì)胞的比例,發(fā)現(xiàn)胃癌組織中的中性粒細(xì)胞的頻率顯著高于癌旁組織(6.81%±0.85%vs4.09%±0.62%, P<0.01)和正常胃組織(6.81%±0.85%vs3.84%±0.35%, P<0.01)。
　　3.將胃癌患者不同類型胃組織(胃癌、癌旁及正常胃組

10、織)標(biāo)本制成石蠟切片,進(jìn)行免疫組化染色,結(jié)果顯示中性粒細(xì)胞在胃癌組織中浸潤增加。
　　4.收集24例胃癌患者外周血和15例健康成人外周血,流式檢測(cè)中性粒細(xì)胞表面趨化因子受體CXCR2和CXCR4的表達(dá),統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示,胃癌患者外周血中的中性粒細(xì)胞表面趨化因子受體 CXCR2的表達(dá)低于健康成人(49.32%±4.27% vs97.80%±0.97%,P<0.01),而 CXCR4的表達(dá)高于健康成人外周血(30.53%±3.20% v

11、s9.91%±1.35%, P<0.05)。
　　5.收集24例胃癌患者不同類型胃組織(胃癌、癌旁及正常胃組織)標(biāo)本,流式檢測(cè)不同類型胃組織標(biāo)本中浸潤的中性粒細(xì)胞表面趨化因子受體 CXCR2和 CXCR4的表達(dá),結(jié)果顯示胃組織中浸潤的中性粒細(xì)胞主要表達(dá)趨化因子受體CXCR4,并且胃癌組織浸潤的中性粒細(xì)胞表達(dá) CXCR4的比例有高于癌旁(24.32%±5.84% vs21.77%±7.45%, p>0.05)及正常胃組織(24.32

12、%±5.84% vs21.86%±7.08%, p>0.05)的趨勢(shì)(無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異)。
　　6.分別用胃癌組織培養(yǎng)上清、正常胃組織培養(yǎng)上清和完全1640培養(yǎng)基刺激健康成人外周血中性粒細(xì)胞后,用7-AAD檢測(cè)中性粒細(xì)胞的存活情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn):胃癌組織培養(yǎng)上清刺激后的中性粒細(xì)胞中7-AAD+的死細(xì)胞比例低于正常胃組織培養(yǎng)上刺激后的死細(xì)胞比例(18.85%±2.35% vs32.45%±1.85%, p<0.05);而正常胃組織培養(yǎng)上清全

13、刺激后中性粒細(xì)胞中的死細(xì)胞比例又低于完全1640刺激后的死細(xì)胞比例(32.45%±1.85%vs74.3%±2.20%, p<0.01)。
　　7.分別用胃癌組織培養(yǎng)上清和正常胃組織培養(yǎng)上清刺激健康成人外周血中性粒細(xì)胞后,與健康成人外周血CD3+T細(xì)胞共培養(yǎng),檢測(cè)CD3+T細(xì)胞的增殖情況,發(fā)現(xiàn)相較于正常胃組織培養(yǎng)上清,胃癌組織培養(yǎng)上清刺激后的中性粒細(xì)胞抑制了 CD3+ T細(xì)胞的增殖(9.10%±1.24%vs5.99%±1.01%