MicroRNa-148a通過靶向調(diào)控DLGAP1促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移.pdf

1、目的:
　　Mir-148a是一種重要的微小RNA(microRNA，miRNA)，其表達(dá)水平的異常與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有密切聯(lián)系。通過前期對大樣本基因組數(shù)據(jù)的挖掘，建立了一個(gè)完整mRNAs和microRNAs的神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(GBM)分子預(yù)后模型，發(fā)現(xiàn)mir-148a和DLGAP1(discs，large homolog associated protein1)在GBM中分別呈現(xiàn)高表達(dá)和低表達(dá)并與病人的生存相關(guān)，生物信息

2、學(xué)預(yù)測發(fā)現(xiàn)DLGAP1是mir-148a的潛在靶基因。本課題以人神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本、人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系為研究對象，研究mir-148a在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本和神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中的表達(dá)水平的變化;構(gòu)建mir-148a過表達(dá)(pre-mir-148a)和mir-148a抑制表達(dá)(anti-mir-148a)慢病毒，篩選并建立穩(wěn)定高表達(dá)及抑制表達(dá)mir-148a的神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系;研究mir-148a對神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、凋亡、遷移及侵襲能力的

3、影響;驗(yàn)證mir-148a與DLGAP1之間的靶向關(guān)系并研究其功能。為進(jìn)一步詮釋GBM發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制和應(yīng)用mir-148a作為GBM診斷和治療的新靶點(diǎn)奠定基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1、運(yùn)用組織芯片及原位雜交的方法檢測人神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織標(biāo)中本mir-148a的表達(dá)水平，運(yùn)用qRT-PCR方法檢測人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中mir-148a的表達(dá)水平;
　　2、根據(jù)人mir-148a序列設(shè)計(jì)并合成前體mir-148a及mir-14

4、8a反向互補(bǔ)序列，構(gòu)建mir-148a過表達(dá)慢病毒和mir-148a抑制表達(dá)慢病毒;感染神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系并通過嘌呤霉素篩選及qRT-PCR檢測mir-148a表達(dá)水平，在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中建立mir-148a過表達(dá)及抑制表達(dá)穩(wěn)定細(xì)胞系;
　　3、通過EdU實(shí)驗(yàn)、CCK8實(shí)驗(yàn)、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)評價(jià)mir-148a對神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖能力的影響;通過劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell遷移及侵襲實(shí)驗(yàn)評價(jià)mir-148a對神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移和侵

5、襲能力的影響;通過流式細(xì)胞術(shù)評價(jià)mir-148a對神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡情況的影響。
　　4、運(yùn)用組織芯片和免疫組織化學(xué)的方法檢測不同級別神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本及正常對照腦組織中DLGAP1的表達(dá)，運(yùn)用qRT-PCR、Western Blot方法檢測人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中DLGAP1的表達(dá);
　　5、運(yùn)用生物信息學(xué)和熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證DLGAP1是否是mir-148a的靶基因，并通過qRT-PCR、Western Blot方法檢

6、測感染了mir-148a過表達(dá)或抑制表達(dá)慢病毒的細(xì)胞系中靶基因mRNA水平和蛋白水平的變化;通過transwell遷移、侵襲實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證mir-148a通過靶向調(diào)控DLGAP1促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移、侵襲。
　　結(jié)果:
　　1、mir-148a在神經(jīng)膠質(zhì)瘤和正常腦組織中均有表達(dá)，與正常腦組織中的mir-148a表達(dá)水平相比較，不同級別的膠質(zhì)瘤組織中mir-148a表達(dá)上調(diào)，腫瘤組織與正常組織之間的mir-148a的表達(dá)水平差

7、異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。與在組織中mir-148a表達(dá)水平檢測結(jié)果相似，mir-148a在正常神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞HA1800和神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87、U251、BT325、T98G、SWO38-C2中均有表達(dá)，與HA1800中mir-148a表達(dá)水平相比較，mir-148a在U87、U251、BT325、T98G、SWO38-C2中的表達(dá)明顯上調(diào)，腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞之間的mir-148a的表達(dá)水平差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

8、
　　2、成功構(gòu)建了mir-148a過表達(dá)慢病毒載體及mir-148a抑制表達(dá)慢病毒載體，并通過嘌呤霉素篩選及qPCR獲得穩(wěn)定過表達(dá)mir-148a及抑制表達(dá)mir-148a的U87、U251、BT325、T98G穩(wěn)定細(xì)胞系。
　　3、CCK8實(shí)驗(yàn)、EdU實(shí)驗(yàn)、平板克隆實(shí)驗(yàn)證實(shí)mir-148a過表達(dá)能夠促進(jìn)U87、U251、BT325、T98G細(xì)胞的增殖，mir-148a表達(dá)下調(diào)抑制U87、U251、BT325、T98G細(xì)胞

9、的增殖;劃痕實(shí)驗(yàn)、transwell遷移實(shí)驗(yàn)、transwell侵襲實(shí)驗(yàn)證實(shí)mir-148a過表達(dá)促進(jìn)U87、U251、BT325的遷移和侵襲，抑制mir-148a表達(dá)時(shí)抑制了U87、U251、BT325的遷移和侵襲;AnnexinⅤ PE/7-AAD染色檢測凋亡結(jié)果發(fā)現(xiàn)mir-148a過表達(dá)抑制U87、BT325、T98G的凋亡，而mir-148a下調(diào)時(shí)促進(jìn)了U87、BT325的凋亡。
　　4、DLGAP1在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞

10、中均有表達(dá)，相比較與正常神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，DLGAP1在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，包括基因水平和蛋白水平，DLGAP1在正常細(xì)胞與神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的表達(dá)水平差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果顯示DLGAP1陽性率隨神經(jīng)膠質(zhì)瘤良惡性級別的增高而相應(yīng)減少，不同級別的膠質(zhì)瘤之間的DLGAP1表達(dá)水平的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);靶基因預(yù)測到mir-148a與DLGAP1之間存在靶向相關(guān)性，構(gòu)建熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒，通

11、過與mir-148a過表達(dá)慢病毒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，熒光素酶報(bào)告基因熒光強(qiáng)度減弱，即活性降低，證明mir-148a可以直接作用于DLGAP1-3'UTR靶序列，下調(diào)DLGAP1的表達(dá);qPCR、Western Blot驗(yàn)證表明mir-148a過表達(dá)時(shí)抑制DLGAP1基因水平、蛋白水平的表達(dá)，mir-148a表達(dá)下調(diào)時(shí)，DLGAP1基因水平、蛋白表達(dá)水平上調(diào)，證實(shí)mir-148a對DLGAP1存在調(diào)控作用;shRNA-DLGAP1慢病毒載

12、體感染U87、U251、BT325后進(jìn)行transwell遷移、侵襲實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DLGAP1受到抑制時(shí)U87、U251、BT325的遷移、侵襲能力增強(qiáng)。
　　結(jié)論:
　　1、神經(jīng)膠質(zhì)瘤中，mir-148a高表達(dá)、DLGAP1低表達(dá)，兩者表達(dá)呈負(fù)相關(guān)性;mir-148a靶向抑制DLGAP1的表達(dá);
　　2、成功構(gòu)建了穩(wěn)定過表達(dá)mir-148a及抑制表達(dá)mir-148a的穩(wěn)定細(xì)胞系;
　　3、mir-148a促進(jìn)神