白細(xì)胞介素1β對(duì)骨髓中性粒細(xì)胞與嗜酸性粒細(xì)胞分化的調(diào)控及其相關(guān)機(jī)制.pdf

1、哮喘是由多種細(xì)胞及細(xì)胞組分，包括嗜酸性粒細(xì)胞(Eos)、中性粒細(xì)胞(Neut)、淋巴細(xì)胞、肥大細(xì)胞等炎癥細(xì)胞及炎癥介質(zhì)、細(xì)胞因子等所形成的氣道內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、黏液分泌增多、氣道高反應(yīng)性(AHR)、成纖維細(xì)胞及上皮細(xì)胞增生、平滑肌細(xì)胞肥大及氣道重塑，其本質(zhì)是一種慢性氣道炎癥。一直以來(lái)，多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)哮喘是以Th2細(xì)胞反應(yīng)為主的嗜酸性粒細(xì)胞性氣道炎癥，對(duì)激素治療效果明顯，而臨床上發(fā)現(xiàn)以中性粒細(xì)胞性氣道炎癥為主的哮喘患者對(duì)激素治療效果不明顯，甚

2、至出現(xiàn)惡化的表現(xiàn)，這部分哮喘又稱之為中性粒細(xì)胞性哮喘，即難治性哮喘、重癥哮喘。由此可見(jiàn)，氣道嗜酸性粒細(xì)胞及中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)在哮喘的病理生理過(guò)程及臨床癥狀的發(fā)展中起關(guān)鍵作用，阻斷氣道嗜酸性粒細(xì)胞及中性粒細(xì)胞性炎癥對(duì)哮喘的治療有決定性意義。
　　白細(xì)胞介素1β(IL-1β)是IL-1家族的成員之一，作為一種重要的前炎癥因子參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)IL-1β在哮喘尤其是重癥哮喘的發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮重要的作用，而且與氣道內(nèi)嗜酸性粒細(xì)

3、胞及中性粒細(xì)胞的升高密切相關(guān)，盡管其機(jī)制并不明確。甚至臨床研究認(rèn)為IL-1β可以作為區(qū)別哮喘和慢性阻塞性肺疾病(COPD)的生物學(xué)標(biāo)記。另外，有文獻(xiàn)報(bào)道IL-1β干預(yù)后可以引起骨髓造血干祖細(xì)胞向髓系的分化，由此我們假設(shè)IL-1β是否可以直接參與骨髓造血干祖細(xì)胞向Neut及Eos分化的調(diào)控，從而為IL-1β在哮喘發(fā)病機(jī)制的探究做鋪墊，開(kāi)拓新的視野，為哮喘的臨床治療提供新的防治靶點(diǎn)。
　　目的:探討IL-1β對(duì)骨髓造血干祖細(xì)胞向中性粒

4、細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞分化的調(diào)控及其相關(guān)機(jī)制，從而為IL-1β在哮喘的發(fā)病機(jī)制提供新的理論契機(jī)。
　　方法:健康同周齡WT小鼠與IL-1R敲除（IL-1 R-/-）小鼠，分為四組:WT小鼠生理鹽水對(duì)照組（WT-NS組），WT小鼠LPS模型組（WT-LPS組），IL-1R-/-小鼠生理鹽水對(duì)照組（IL-1R-/--NS組）及IL-1R-/-小鼠LPS模型組（IL-1R-/--LPS組）。氣道滴注脂多糖(LPS)（1mg/kg小鼠）或者生

5、理鹽水(NS)，24小時(shí)內(nèi)檢測(cè)支氣管肺泡灌洗液(BALF)和外周血中性粒細(xì)胞比例;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)和分析骨髓中性粒細(xì)胞(Gr-1+CD11b+)，并進(jìn)一步分析原始中性粒細(xì)胞(Pro/mye，Gr-1intCD11bint)，非成熟中性粒細(xì)胞(imNeut，Gr-1hiCD11blo)及成熟中性粒細(xì)胞(mNeut，Gr-1hiCD11bhi)這三群細(xì)胞的比例。其中原始中性粒細(xì)胞(Pro/mye)包括原幼粒細(xì)胞和中幼粒細(xì)胞，非成熟中性粒細(xì)胞(

6、imNeut)包括晚幼粒細(xì)胞和桿狀粒中性粒細(xì)胞，成熟中性粒細(xì)胞(mNeut)即分葉核中性粒細(xì)胞。利用IL-1R-/-小鼠與WT小鼠構(gòu)建骨髓移植及Neut炎癥模型:健康C57BL/6雌鼠作為受體鼠先接受化療，腹腔注射白消胺(BU)，30mg/kg，每日1次，連續(xù)4天，腹腔注射環(huán)磷酰胺(CTX)，50mg/kg，每日1次，連續(xù)2天，中間休息1天后，第8天，提取同周齡的供體鼠（IL-1R-/-雄鼠與WT雄鼠）的骨髓細(xì)胞，按2-4×107cel

7、ls/小鼠為受體雌鼠進(jìn)行尾靜脈注射，待第21天受體鼠骨髓造血系統(tǒng)基本恢復(fù)進(jìn)行造模，隨機(jī)分為四組:WT小鼠回輸生理鹽水對(duì)照組（WT-WT-NS組）、WT小鼠回輸LPS模型組(WT-WT-LPS組)、敲除小鼠回輸生理鹽水對(duì)照組（IL-1R-/--WT-NS組）、敲除小鼠回輸LPS模型組（IL-1R-/--WT-LPS組），氣道滴注NS及LPS（1ug/g小鼠）24時(shí)內(nèi)進(jìn)行模型處理，檢測(cè)方法同上。體外Neut克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)IL-1β對(duì)Neu

8、t分化的影響，液態(tài)培養(yǎng)誘導(dǎo)骨髓Neut分化并流式檢測(cè)Neut、AnnexinⅤ/PI、E.coli吞噬等進(jìn)一步研究IL-1β干預(yù)對(duì)Neut分化、凋亡及功能的影響。實(shí)時(shí)定量PCR(Q-PCR)檢測(cè)骨髓Neut分化過(guò)程中關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，包括G-CSFR、C/EBPε、PU.1及C/EBPα的mRNA表達(dá)。同時(shí)，體外半固態(tài)及液態(tài)培養(yǎng)檢測(cè)IL-1β對(duì)嗜酸性粒細(xì)胞(Eos)分化的影響:Eos半固態(tài)克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)并比較對(duì)照組（IL-5）及實(shí)驗(yàn)組(I

9、L-5+IL-1β)Eos的克隆形成情況;流式檢測(cè)液態(tài)誘導(dǎo)Eos分化過(guò)程中IL-5和或IL-1β干預(yù)后Eos的(SiglecF+)水平，并利用BrdU方法檢測(cè)Eos增殖及凋亡水平;Q-PCR檢測(cè)Eos分化過(guò)程中關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子GATA-1及重要調(diào)控分子MBP-1的表達(dá)。
　　結(jié)果:在Neut炎癥模型中，與WT-LPS組相比，IL-1R-/-LPS組BALF-Neut總數(shù)有下降趨勢(shì)，盡管沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，P=0.0571)，

10、外周血Neut比例明顯降低(P＜0.05)，骨髓Pro/mye比例無(wú)明顯變化(P＞0.05)，但是骨髓imNeut比例明顯增加(P＜0.05)，mNeut比例明顯降低(P＜0.001)。利用IL-1R-/-小鼠與WT小鼠進(jìn)行骨髓移植并構(gòu)建Neut炎癥模型，比較IL-1R-/-WT-LPS組與WT-WT-LPS組，前者BALF-Neut比例有下降趨勢(shì)，盡管沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，P=0.0503)，外周血Neut炎癥明顯緩解(P＜0

11、.01)，骨髓Pro/mye比例無(wú)明顯變化(P＞0.05)，骨髓imNeut比例變化也不明顯(P＞0.05)，而mNeut比例明顯降低(P＜0.001)。中性粒細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化液態(tài)培養(yǎng)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IL-1β單獨(dú)干預(yù)對(duì)Neut的分化無(wú)明顯影響(P＞0.05)，而在G-CSF的協(xié)同作用下可以明顯促進(jìn)Neut的分化(P＜0.001)，但對(duì)Neut凋亡抑制作用不明顯(P＞0.05)，并對(duì)Neut吞噬功能也有一定的促進(jìn)作用(P＜0.05)。體外半固

12、態(tài)培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，IL-1β在G-CSF協(xié)同的作用下明顯促進(jìn)Neut-CFU的形成(P＜0.01)。Q-PCR檢測(cè)Neut分化過(guò)程中關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與WT-NS組相比，WT-LPS組G-CSFR、C/EBPε、PU.1及C/EBPα的mRNA表達(dá)水平升高(P＜0.05)，而IL-1R-/--LPS組骨髓G-CSFR、 C/EBPε、PU.1及C/EBPα的mRNA表達(dá)水平與IL-1R-/-NS組比較則無(wú)明顯變化(P＜0.05)。嗜酸性

13、粒細(xì)胞體外半固態(tài)及液態(tài)培養(yǎng)結(jié)果:Eos半固態(tài)克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組(IL-5)Eo-CFU數(shù)量與對(duì)照組（IL-5）相比無(wú)明顯變化(P＞0.05);Eos液態(tài)培養(yǎng)誘導(dǎo)分化，第8-10天收集細(xì)胞流式檢測(cè)Eos分化水平及凋亡情況，結(jié)果顯示在IL-5的作用下，Eos逐漸分化成熟，但I(xiàn)L-1β干預(yù)后并不影響Eos的分化(P＞0.05)，且實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組中Eos相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(GATA-1)及重要調(diào)控蛋白(MBP-1)的mRNA表達(dá)也無(wú)明顯差別(

14、P＞0.05)。Eos液態(tài)培養(yǎng)第10天進(jìn)行BrdU流式檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，盡管實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比S期細(xì)胞比例無(wú)明顯差別，但凋亡細(xì)胞群卻明顯減少。
　　結(jié)論:IL-1β在G-CSF協(xié)同作用下明顯促進(jìn)Neut的分化，這一作用可能是通過(guò)上調(diào)G-CSFR、C/EBPε、PU.1及C/EBPα的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)，而單獨(dú)作用影響不明顯。同時(shí)，IL-1β還能促進(jìn)Neut的吞噬功能，但對(duì)其凋亡無(wú)明顯影響。另外，IL-1β不影響骨髓Eos的分化與增殖，但是能抑制E