嗜酸性粒細(xì)胞促進(jìn)造血干細(xì)胞動(dòng)員的調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、支氣管哮喘是一種由過敏原引起的由嗜酸性粒細(xì)胞(eosinophil，Eos)，肥大細(xì)胞，T淋巴細(xì)胞等多種細(xì)胞和細(xì)胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾病，其臨床特點(diǎn)為氣道高反應(yīng)性(hyperresponsiveness，AHR)，以及可逆性的氣流受限。導(dǎo)致其病理的根本原因是Eos的氣道局部的大量聚集，且Eos的數(shù)量與哮喘的嚴(yán)重程度相關(guān)。目前全球有3億多人患有哮喘，中國哮喘患者已超過4000萬。哮喘給家庭以及整個(gè)社會(huì)產(chǎn)生了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。目前以吸入

2、型糖皮質(zhì)激素為首選的治療方案可以較好的控制哮喘的癥狀，但尚不能完全根治。目前對(duì)哮喘發(fā)病機(jī)制，病理學(xué)以及防治仍然是本領(lǐng)域研究的挑戰(zhàn)，更好的研究Eos，并控制Eos為主的炎癥也是本領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。
　　Eos是外周血的成熟白細(xì)胞的一種，呈橢圓形，因其胞漿內(nèi)部充滿粗大、整齊、均勻、排列緊密的嗜酸性顆粒而命名。正常人血液中嗜酸性粒細(xì)胞的水平較低，比例為白細(xì)胞總數(shù)的0.5％-5％，絕對(duì)值為0.05-0.5*10^9/L，Eos數(shù)量少但是作用

3、非常重要。目前已經(jīng)有很多關(guān)于Eos在哮喘中的病理機(jī)制研究，包括:聚集在氣道周圍的Eos釋放其特異性的胞質(zhì)顆粒蛋白如主要堿性蛋白-1(major basic protein-1，MBP-1)，嗜酸性粒細(xì)胞陽離子蛋白(eosinophil cationic protein，ECP)等破壞氣道上皮細(xì)胞等局部組織;釋放白介素-13(interlukin，IL-13)，IL-4等炎癥因子，刺激杯狀細(xì)胞增生，粘液高分泌以及AHR的產(chǎn)生;長期的慢性炎

4、癥過程中，Eos還分泌轉(zhuǎn)化生長因子-β（Transforming growth factor-β，TGF-β）等與組織修復(fù)有關(guān)的蛋白，導(dǎo)致局部平滑肌增生，纖維沉積等病理現(xiàn)象。
　　除參與哮喘的病理過程以外，Eos還在抗寄生蟲感染的宿主免疫反應(yīng)中其重要作用，包括分泌MBP直接破壞寄生蟲細(xì)胞壁，分泌相應(yīng)抗體而殺傷。Eos還是一種重要的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞，其功能包括激活肥大細(xì)胞，促進(jìn)其分泌組胺和前列腺素等，參與后續(xù)的過敏性反應(yīng);以及處理并提呈

5、一系列微生物，病毒和寄生蟲抗原擔(dān)任抗原提呈細(xì)胞的角色;Eos還能調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞的功能，活化的Eos可以促進(jìn)免疫反應(yīng)中T細(xì)胞的增殖，并通過提呈可溶性抗原給CD4+T細(xì)胞來調(diào)節(jié)Th1/2的極化。Eos還參與腫瘤的免疫反應(yīng)過程，如通過招募CD8+的T細(xì)胞來促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用等。
　　Eos由造血干細(xì)胞在一系列復(fù)雜轉(zhuǎn)錄因子和細(xì)胞因子的調(diào)控之下定向分化而來，Eos是造血干細(xì)胞的終末成熟血細(xì)胞。二者之間除分化關(guān)系外并無其他研究報(bào)道。本團(tuán)隊(duì)

6、前期研究發(fā)現(xiàn)在小鼠的哮喘模型中，出現(xiàn)骨髓與外周脾臟干細(xì)胞LSK(lineageSca-1+c-kit+)數(shù)量的增加，即干細(xì)胞的增殖和動(dòng)員現(xiàn)象。而在Eos缺失的Phil小鼠中，則發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞數(shù)量的減少。提示Eos可能反過來對(duì)其上級(jí)的造血干細(xì)胞有一種促進(jìn)動(dòng)員調(diào)控作用?；诖思僭O(shè)，我們利用了IL-5過表達(dá)導(dǎo)致的Eos大量存在的NJ.1638小鼠與Phil小鼠進(jìn)行了一系列骨髓移植，體外共培養(yǎng)體系等實(shí)驗(yàn)，深入的研究了Eos與造血干細(xì)胞之間的調(diào)控關(guān)系

7、。
　　目的:
　　明確Eos對(duì)干細(xì)胞動(dòng)員的調(diào)控作用，并進(jìn)一步研究其機(jī)制。
　　方法:
　　1.整體模型
　　利用6-10周齡的同窩生的野生型(Wild Type，WT)小鼠與Phil小鼠，雌雄不限，以雞卵清蛋白(OVA)致敏以及霧化攻擊，建立經(jīng)典的哮喘模型，以多色流式分析法標(biāo)記骨髓與脾臟來源的LSK水平的干細(xì)胞，觀察其增殖與動(dòng)員的現(xiàn)象;分析NJ.1638體內(nèi)的干細(xì)胞水平及其ROS水平，觀察Eos大量增加對(duì)

8、干細(xì)胞的影響;將NJ.1638與Phil小鼠雜交后分析骨髓與外周的干細(xì)胞水平，明確Eos對(duì)干細(xì)胞的調(diào)控關(guān)系;對(duì)WT和Phil小鼠腹腔注射經(jīng)典的骨髓動(dòng)員劑G-CSF，觀察干細(xì)胞動(dòng)員的現(xiàn)象。
　　2.骨髓移植
　　進(jìn)行WT小鼠和NJ.1638小鼠之間的非競爭性和競爭性骨髓移植方案，觀察Eos與干細(xì)胞活化的關(guān)系及其干細(xì)胞的分化功能;利用DCFH FA熒光染料標(biāo)記活性氧自由基(ROS)，檢測ROS水平;利用流式分選的方法純化LSK，

9、與Eos進(jìn)行體外培養(yǎng)，觀察Eos對(duì)LSK的影響，找尋其機(jī)制。
　　結(jié)果:
　　1.哮喘模型中，Eos的缺失導(dǎo)致干細(xì)胞動(dòng)員現(xiàn)象的減弱。表現(xiàn)為與WT小鼠相比，Phil小鼠脾臟中干細(xì)胞數(shù)量增加減少。
　　2.NJ.1638骨髓中LSK數(shù)量明顯減少，而脾臟中LSK的數(shù)量則高于骨髓，提示干細(xì)胞動(dòng)員的現(xiàn)象;NJ.1638體內(nèi)的干細(xì)胞呈高ROS水平。
　　3.NJ.1638與Phil小鼠雜交后體內(nèi)高IL-5但缺乏Eos的小鼠中

10、，干細(xì)胞動(dòng)員的現(xiàn)象消失，提示Eos與干細(xì)胞動(dòng)員直接相關(guān)。
　　4.Eos不影響G-CSF導(dǎo)致的骨髓動(dòng)員現(xiàn)象。
　　5.NJ.1638與WT小鼠的骨髓移植實(shí)驗(yàn)說明Eos數(shù)量的變化與干細(xì)胞動(dòng)員的趨勢(shì)直接相關(guān)，且NJ.1638來源的干細(xì)胞分化能力下降。
　　6.NJ.1638來源的干細(xì)胞歸巢能力并沒有下降。
　　7.Eos與流式分選后的LSK共培養(yǎng)可以促進(jìn)其ROS的產(chǎn)生。
　　結(jié)論:
　　Eos數(shù)量的增加可