Mre11蛋白相互作用蛋白的篩選及驗(yàn)證.pdf

1、生物體基因組DNA時(shí)常會(huì)受到一系列內(nèi)源或外源DNA損傷試劑的作用而出現(xiàn)DNA斷裂。如果DNA雙鏈斷裂不能得到及時(shí)有效地修復(fù)，會(huì)導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定性，如染色體缺失，多拷貝染色體等，引起多種人類(lèi)疾病。在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中，生物有機(jī)體形成了一系列DNA損傷修復(fù)機(jī)制，以應(yīng)對(duì)損傷的DNA。MRN復(fù)合物是參與DNA損傷修復(fù)的一個(gè)關(guān)鍵分子，由Mre11、NBS1和RAD50蛋白組成。研究發(fā)現(xiàn)MRN復(fù)合物在DNA雙鏈損傷修復(fù)、同源重組、非同源末端連接、端粒

2、結(jié)構(gòu)維持、細(xì)胞周期檢驗(yàn)點(diǎn)激活、DNA復(fù)制順利進(jìn)行，以及維持基因組的穩(wěn)定性等方面都發(fā)揮著重要的作用，因此對(duì)于MRN復(fù)合物功能以及其發(fā)揮功能的機(jī)制的研究就顯得至關(guān)重要。
　　 本文以Mre11蛋白N端335個(gè)氨基酸殘基作為誘餌蛋白(Mre11N335)，通過(guò)酵母雙雜交系統(tǒng)，從黑腹果蠅21小時(shí)胚胎cDNA文庫(kù)中篩選與Mre11蛋白相互作用的分子，從而對(duì)其發(fā)揮功能的機(jī)制進(jìn)行深入研究。以CG1945酵母菌作為宿主菌，通過(guò)SD-T-L-H-

3、3AT營(yíng)養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基進(jìn)行初篩，初篩得到的陽(yáng)性克隆通過(guò)檢測(cè)β半乳糖苷酶活性進(jìn)一步篩選，將篩選到的陽(yáng)性克隆連續(xù)涂三次SD-T-L-H-3AT營(yíng)養(yǎng)缺陷培養(yǎng)板，丟失酵母菌中沒(méi)有與Mre11N335蛋白發(fā)生相互作用的文庫(kù)質(zhì)粒。提取酵母菌中的質(zhì)粒，用通用引物PCR擴(kuò)增文庫(kù)插入片段，HaeⅢ酶切PCR產(chǎn)物，根據(jù)PCR產(chǎn)物和酶切產(chǎn)物片段大小對(duì)克隆進(jìn)行分組歸類(lèi)，去除重復(fù)。將分類(lèi)后得到的質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌，提取質(zhì)粒，再次進(jìn)行PCR擴(kuò)增，HaeⅢ酶切，進(jìn)一

4、步進(jìn)行分組歸類(lèi)。將分類(lèi)后得到的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與果蠅基因的cDNA序列進(jìn)行比對(duì)，將與果蠅基因cDNA序列讀碼框一致的克隆挑選出來(lái)進(jìn)行體內(nèi)和體外再驗(yàn)證。體內(nèi)通過(guò)共轉(zhuǎn)AH109酵母菌、AH109酵母菌和Y187酵母菌雜交以及移碼突變?nèi)齻€(gè)實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證。通過(guò)體內(nèi)再驗(yàn)證篩選到五個(gè)與Mre11N335蛋白相互作用的基因，分別為CG4035(eIF-4E)，CG1216(mri)，CG4916(me31B)，CG5468(TweedleM)和CG