抗沉默因子Asf1調控嗜熱四膜蟲細胞核的穩(wěn)定性.pdf

1、組蛋白分子伴侶能協(xié)助組蛋白參與染色質的組裝和解凝，進而調控基因的表達，對核小體的組裝解凝起到了重要作用。不同組蛋白分子伴侶對核小體裝配解凝有不同的作用，進而影響核小體的穩(wěn)定性、結構以及染色體狀態(tài)，從而影響生物的發(fā)育過程。高等真核生物細胞中組蛋白異二聚體H3/H4的分子伴侶Asf1(anti-silencing function1，Asf1)參與依賴DNA復制及不依賴DNA復制的核小體裝配，同時參與轉錄調控，基因沉默以及DNA損傷修復等過

2、程，在不同生物中Asf1具有一定的功能保守性，同時進化出新的功能。
　　嗜熱四膜蟲是一種重要的真核模式生物，細胞包含一個二倍體的生殖小核和一個多倍體的體細胞大核。在營養(yǎng)生長時期，嗜熱四膜蟲細胞小核進行有絲分裂，而大核進行無絲分裂；在有性生長時期，細胞進行配對，小核通過減數分裂和有絲分裂產生配子核，新大核通過合子核基因重排形成，親本大核凋亡。四膜蟲核的二態(tài)性及多樣化的核發(fā)育形態(tài)成為研究組蛋白及其分子伴侶重要的模式體系。本研究對組蛋白

3、分子伴侶Asf1在四膜蟲細胞中的功能進行了系統(tǒng)分析，獲得主要結果如下：
　　1.嗜熱四膜蟲中ASF1基因生物信息學分析嗜熱四膜蟲ASF1（TTHERM_00442300）基因全長756 bp，無內含子，預測編碼的 N端1～155位是保守的Asf1功能結構域，酸性 C端區(qū)域參與調節(jié)功能，N端結構域序列同源進化樹分析表明， Asf1的分子進化與物種進化基本一致。RT-PCR結果表明，ASF1在嗜熱四膜蟲的各個時期均有表達，并且在有性生

4、殖4~6h轉錄水平達到最高。
　　2. HA-Asf1定位在大核和小核我們構建了重組質粒pNeo-HA-ASF1，并將其轉化四膜蟲細胞，巴龍霉素抗性條件下篩選得到穩(wěn)定表達HA-Asf1的細胞株。通過免疫熒光定位分析表明，HA-Asf1在營養(yǎng)生長時期，饑餓時期以及有性生長時期定位于大核、小核以及新形成的大小核中，發(fā)育前期大核的信號更強，而到了Anlagen時期小核信號增強，而在即將凋亡的親本大核中，定位信號逐漸減弱最后消失。

5、　　3.過表達ASF1后核變大并影響細胞的增殖構建過表達pXS-ASF1重組質粒并將其轉入野生型四膜蟲細胞，通過巴龍霉素篩選，PCR鑒定，ASF1通過同源重組替代MTT1基因，使ASF1在Cd2+誘導下受MTT1啟動子調控而過量表達Asf1。過表達ASF1后，免疫熒光定位分析HA-Asf1在四膜蟲營養(yǎng)生長期、饑餓期和有性生長期定位于大核、小核以及新形成的大小核中。定位模式與在自身啟動子調控下Asf1的定位模式基本一致。過表達ASF1細胞

6、株的大核小核均出現(xiàn)核型變大，并抑制細胞增殖。
　　4.敲減ASF1后導致大核形態(tài)異常及小核缺失構建敲除質粒pNeo-ASF1并轉入野生型四膜蟲細胞，通過巴龍霉素篩選，PCR鑒定，Neo4部分替代ASF1基因。敲減ASF1的細胞株篩選過程出現(xiàn)無小核細胞株，細胞生長抑制，不能進行正常的有性生殖過程和產生有性生殖后代。大核形態(tài)異常，部分細胞觀察到有大核逐出體的存在。
　　嗜熱四膜蟲Asf1是進化上保守的功能蛋白，含有保守的功能結構