嗜熱四膜蟲中染色體濃縮調(diào)節(jié)因子RCC1的鑒定及功能分析.pdf

1、Ran(Ras-like nuclear protein)是一種在真核生物中高度保守的小分子GTPase蛋白,屬于小G蛋白家族。Ran蛋白與不同的調(diào)節(jié)因子和輔助因子相互作用,參與核膜重建、紡錘體的組裝、DNA復(fù)制、細胞周期的調(diào)節(jié)和核質(zhì)間物質(zhì)的運輸?shù)取an蛋白在其輔助蛋白的調(diào)控下進行RanGTP和RanGDP兩種結(jié)合態(tài)之間不斷循環(huán)轉(zhuǎn)變,表現(xiàn)出功能的多樣性。
　　染色體濃縮調(diào)節(jié)因子RCC1(regulator of chromoso

2、me condensation1)是唯一已知的Ran的鳥嘌呤核苷酸交換因子,含有保守的RLD(RCC1-like domain)結(jié)構(gòu)域,與Ran蛋白結(jié)合,促進Ran-GDP轉(zhuǎn)變?yōu)镽anGTP結(jié)合態(tài),從而促進核質(zhì)運輸,同時在染色體端粒沉默、細胞周期的調(diào)控和微管的組裝發(fā)揮重要功能。
　　嗜熱四膜蟲(Tetrahymena thermophila)是一種營自由生活的淡水單細胞原生生物,具有核的二態(tài)性,即含有多倍體的體細胞大核和二倍體生殖

3、小核。生殖方式主要有無性生殖和有性生殖兩種方式。無性生殖時期,大核無絲分裂而小核進行有絲分裂;有性生殖時期,小核進行減數(shù)分裂和有絲分裂后進行核的交換進而形成合子核,產(chǎn)生新的大核和小核而舊大核降解。嗜熱四膜蟲細胞中核結(jié)構(gòu)精細動態(tài)的變化使其成為研究細胞核結(jié)構(gòu)和發(fā)育的良好模式生物。本課題組先前研究表明嗜熱四膜蟲中 Ran和 RanBP1蛋白調(diào)控了大核的無絲分裂,它們的異常表達會使細胞增殖速度變慢,但至今還沒有發(fā)現(xiàn)關(guān)于嗜熱四膜蟲中RCC1蛋白的

4、相關(guān)研究。
　　本研究首次從嗜熱四膜蟲大核基因組中鑒定出一個新的 RCC1基因,并在生物信息學(xué)水平和細胞分子水平進行了分析,研究結(jié)果如下:
　　1.生物信息學(xué)分析通過同源序列比對,我們從四膜蟲基因組數(shù)據(jù)庫(http://www.ciliate.org)鑒定了人的 RCC1同源物 TTHERM_00530380基因,該基因全長2541 bp,開放閱讀框2181 bp,預(yù)測編碼726個氨基酸。對其氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)RCC1含有一

5、個RLD結(jié)構(gòu)域,將其編碼基因命名為四膜蟲RCC1。Real-time PCR檢測RCC1的轉(zhuǎn)錄水平,發(fā)現(xiàn)RCC1在嗜熱四膜蟲不同細胞周期中都有表達,并在有性生殖時期表達水平達到最高。本研究結(jié)果與四膜蟲功能基因組數(shù)據(jù)庫(http://tfgd.ihb.ac.cn)中該基因的microarray表達譜相一致,進一步證實了RCC1在四膜蟲發(fā)育過程中的動態(tài)表達。聚類分析表明 RCC1分子進化和物種進化相一致,表明了在生物進化過程中,RCC1蛋白

6、具有保守的功能。
　　2. HA-RCC1的細胞定位構(gòu)建含有 HA標簽的重組質(zhì)粒 pXS75-RCC1,將pXS75-RCC1轉(zhuǎn)入野生型的B2086和Cu428四膜蟲細胞中,通過同源重組RCC1基因替代MTT1基因,RCC1在Cd2+誘導(dǎo)下受到MTT1基因啟動子的調(diào)控,梯度增加巴龍霉素濃度篩選突變體細胞株,通過PCR鑒定獲得整合HA-RCC1基因的突變體細胞株。HA單克隆抗體免疫熒光定位分析表明,在營養(yǎng)生長期,HA-RCC1特異地

7、定位于大核和小核,饑餓時期同樣定位于大核和小核中,在有性生殖時期,親本大核和小核仍有定位。此外 RCC1還定位于降解的舊大核上,直到親本大核完全降解,表明RCC1是細胞核特異的功能因子。
　　3. RCC1的過表達影響細胞核分裂在MTT1啟動子調(diào)控下的HA-RCC1基因,通過不同濃度的Cd2+誘導(dǎo),實現(xiàn)HA-RCC1基因的過表達。通過DAPI染料對過表達RCC1的細胞株中的細胞核進行染色,觀察細胞核分裂的過程。分析過表達HA-RC

8、C1對細胞發(fā)育的影響,結(jié)果顯示 RCC1過量表達導(dǎo)致細胞中大核無絲分裂異常,進而抑制了大核的無絲分裂,最終產(chǎn)生部分無大核的異常細胞。
　　4. RCC1的敲減引起小核異常分裂為了進一步分析RCC1的功能,構(gòu)建了RCC1基因敲除質(zhì)粒pNeo4-RCC1,pNeo4-RCC1轉(zhuǎn)化野生型四膜蟲細胞,通過巴龍霉素濃度梯度篩選,細胞表型分配獲得 RCC1基因敲減突變體細胞株。結(jié)果表明 RCC1基因?qū)蟠陌l(fā)育是必須的。進一步分析RCC1敲減

9、對細胞發(fā)育的影響,DAPI染色敲減 RCC1細胞株,觀察細胞核分裂的過程,發(fā)現(xiàn)發(fā)育的細胞中產(chǎn)生多個小核,大核無絲分裂受到抑制,而且抑制了細胞增殖速率。
　　總之,本研究首次從嗜熱四膜蟲中鑒定出一個新的RCC1基因,RCC1的異常表達影響了細胞正常的核分裂,這種異常表型與Ran1的突變體GTP鎖定態(tài)和GDP鎖定態(tài)、異常表達RanBP1的表型是一樣的,暗示RCC1可能通過改變Ran-GTP的濃度梯度,進而影響細胞的核發(fā)育。RCC1的正