含有HMg-box的HmgB3在嗜熱四膜蟲細胞中的功能分析.pdf

1、高遷移率族蛋白（high mobility group protein，HMG）是一系列的染色體非組蛋白，普遍存在于真核細胞中。根據HMG蛋白不同序列的相似性以及與DNA結合的特性可將經典的HMG蛋白分為三類:HMGA，含有AT-hook結構域;HMGB，含有HMG-box結構域;HMGN，含有獨特的核小體結合結構域。HMG-box高度保守，含有一個特征性的DNA結合結構域，即可由大約80個氨基酸形成3段α螺旋成“L”型折疊，其可插入到

2、DNA小溝處并與DNA小溝相結合。包含有HMG-box的HMGB蛋白在細胞核內發(fā)揮著重要的作用，如參與DNA復制，轉錄，修復，重組，細胞的分化，凋亡等。嗜熱四膜蟲（Tetrahymena thermophila）是一種單細胞的原生動物，具有核二態(tài)性，即一個二倍體的生殖小核和一個多倍體的體細胞大核。在四膜蟲內，兩種不同的HMGB家族蛋白HMG B和HMG C已經被研究，HMG C只定位于大核，HMG B在大核和小核中都存在，并且HMG B

3、可能參與DNA復制。
　　本研究從四膜蟲基因組數據庫中鑒定了一種新的包含有HMG-box的基因HMGB3，對其結構及其定位進行了分析，獲得的主要結果如下：⑴HMGB3的生物信息學分析HMGB3(TTHERM_00155590)擬編碼670個氨基酸，在其N端含有一個HMG-box結構域，中間區(qū)域富含堿性的絲氨酸賴氨酸，C端則是一個中性的結構域，磷酸化分析表明C端結構域的S598，S602，S603，S612，S614，S615和S6

4、167個位點可能被磷酸化從而形成一個酸性的C端結構域。RT-PCR結果表明HmgB3在營養(yǎng)生長時期只有很低的表達，在接合時期上調并在2～4 h達到最高值，這與Microarray分析的結果相一致。⑵HmgB3在細胞內的定位構建含有HA-tag的表達載體pBX-HA-HMGB3，并將其成功轉化四膜蟲細胞CU428和B2086，通過逐級增加巴龍霉素的濃度經過PCR鑒定獲得穩(wěn)定的陽性細胞株。通過對HA-HmgB3免疫定位發(fā)現，在營養(yǎng)生殖時期，

5、HmgB3特異地定位于小核上。在饑餓時期，HmgB3則定位于小核的外周。在接合時期，HmgB3則特異地定位于有絲分裂和減數分裂的功能小核上，而在降解的小核中沒有定位。過表達的HmgB3異常定位于新形成的大核上，進而導致有性生殖產生的子代的存活率僅達正常的50％左右。⑶截短型HmgB3在細胞內的定位為了研究HmgB3特異地定位機制，我們構建了不同的HmgB3的截短型表達載體以了解HmgB3的不同結構域在HmgB3定位中所起的作用。通過免疫